125I放射性粒子对荷人结肠癌裸鼠治疗效应的实验研究

任利彬，周正，杜云峰，许建华，沈恩允，王仙斌，高旭

125I放射性粒子对荷人结肠癌裸鼠治疗效应的实验研究

任利彬，周正，杜云峰，许建华，沈恩允，王仙斌，高旭

【摘要】

目的观察125I 放射性粒子组织间植入对裸鼠皮下人结肠癌移植瘤的局部抑制作用。

方法雌性 Balb/c 裸鼠 20 只，以人 Colo205 型结肠癌细胞建立裸鼠皮下人结肠癌实体肿瘤模型，待肿瘤体积长至理想大小，随机分成 2 组，对照组不予任何处理，治疗组给予移植瘤以125I 放射性粒子组织间植入，每周测量 2 次肿瘤体积，治疗 27 d 后，处死裸鼠，观察移植瘤的相对肿瘤体积（RTV）、相对肿瘤增殖率（T/C）、ABC 免疫组化染色观察肿瘤增殖率[Brdu 标记指数（LI）]。

结果治疗 27 d 后，裸鼠均存活。治疗组（125I 粒子组）移植瘤的 RTV 为（251.59 ± 72.24），明显小于对照组的RTV（1087.94 ± 510.72），相对肿瘤增殖率为 23.13%，明显减少，治疗组的 LI 为（15.00 ± 5.00），明显小于对照组的 LI（38.75 ± 6.29）。

结论①人 Colo205 型结肠癌模型是放射性粒子植入治疗大肠癌基础研究的良好模型之一；②125I 放射性粒子对人结肠癌细胞增殖有明显的局部抑制作用；③125I 放射性粒子在肿瘤体内累积一定剂量才会逐渐显现治疗效应。

【关键词】结肠肿瘤； 碘放射性同位素； 大鼠，裸；疾病模型，动物

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2010, 5(6):434-437

125I 放射性粒子组织间植入近距离放疗是近年发展起来的一种肿瘤内放射的微创治疗方法，因其可操作性强、疗效明确、并发症少，能明显改善患者的生存质量[1-4]。我们采用人 Colo205 结肠癌细胞建立裸鼠结肠癌模型，行125I 放射性粒子组织间植入近距离放射治疗，观察其对肿瘤生长的抑制作用，旨为临床的治疗提供一定的实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料和仪器

雌性 Balb/c 裸鼠 20 只（合格证：SCXK 京2009-0004），SPF 级，6 ～ 8 周，体重 18 ～ 20 g，中国医学科学院实验动物研究所提供，于 SPF 级动物实验室饲养。

人 Colo205 型结肠癌细胞株，来自美国标准菌种收藏所（American type culture collection，ATCC），编号：CCL-222，由北京同为时代生物科技股份有限公司惠赠；125I 粒子：活度 29.6 MBq（0.8 mCi），北京智博高科生物技术有限公司产品，批号 2BS0908-13-01；ABC 检测试剂（PK-4002）购自中杉金桥生物科技有限公司；细胞培养基：改良型 1640 medium，编号 nul0215，购自美国Hyclone 公司；胰酶：编号 533715，美国 Gibico 公司产品；细胞孵化箱 MCO-15AC 为日本 Sanyo公司产品；Olympus BX51 显微镜照相系统为日本Olympus 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 人 Colo205 型结肠癌细胞的培养 将冻存于液氮中的人 Colo205 型结肠癌细胞复苏，常规培养于含 10% 小牛血清的 RPMI1640 培养液中，于 37 ℃、5% CO2培养箱内培养，采取胰酶消化法培养至细胞个数约 8 × 107，经检测细胞活度96%，将细胞制成浓度为 5 × 106/200 μl 的单细胞悬液。

1.2.2 裸鼠皮下移植瘤模型建立 于生物安全柜内，用 1 ml 注射器取 200 μl 的单细胞悬液，以碘伏溶液消毒裸鼠右腹部皮肤，将细胞悬液接种于Balb/c 裸鼠右腹部皮下。

1.2.3 移植瘤内植入125I 粒子 裸鼠皮下接种癌细胞后约 7 d，皮下移植瘤大小约 0.8 cm，随机分成两组，对照组不予任何处理，治疗组给予移植瘤以125I 粒子植入。棉签蘸取少许碘伏溶液消毒肿瘤组织及周围皮肤，在远心端离肿瘤组织 0.5 cm 处皮肤进针，皮下斜行穿入肿瘤组织内，使穿刺针末端位于肿瘤组织的中心，退出针芯，以无菌镊夹取125I 放射性粒子通过植入器末端，以针芯将125I 放射性粒子推至肿瘤中心，然后缓慢退出粒子植入器，退出过程防止粒子随之退出，棉签按压穿刺点数秒，无活动性出血后，将裸鼠放回鼠笼。

1.2.4125I 粒子植入术后数据获得 两组裸鼠每隔3 ～ 4 d 用游标卡尺测量肿瘤最长径（a）及与之垂直的最宽径（b），利用公式，肿瘤体积（TV）= a × b2/2 计算肿瘤体积，再换算为相对肿瘤体积（RTV）= Vt/V0（V0为开始给药时测量的 TV，Vt为给药后每次测量的 TV），相对肿瘤增殖率T/C（%）= RTV治疗组/ RTV对照组× 100%。治疗 27 d，处死裸鼠前 6 h 经腹腔注入 5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）液，取裸鼠肿瘤甲醛固定，制作蜡块、切片、ABC 免疫组化染色。在显微镜下随机计数10 个高倍视野中细胞总数及 Brdu 阳性细胞数，Brdu 阳性细胞数与细胞总数的比值为 Brdu 标记指数（LI），从而反映肿瘤的增殖率。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 人 Colo205 型结肠癌细胞培养及裸鼠皮下移植瘤模型建立

经过 7 d 的细胞培养，所培养人 Colo205 型结肠癌细胞达到实验所需细胞个数，约为 1 × 108/只，最后调定细胞浓度为 5 × 106/200 μl，经检测细胞活度为 96%。

表 1 裸鼠皮下移植瘤相对肿瘤体积（RTV）（%）Table 1 The relative tumor volume (RTV) of nudemice transplantated tumor (%)

人 Colo205 型结肠癌细胞皮下注射于 Balb/c裸鼠右腹部，生长约 7 d 后，可观察到裸鼠皮下直径约 0.8 cm 的肿瘤结节。裸鼠皮下致瘤率 100%。

2.2 裸鼠皮下肿瘤体积变化

实验开始后，125I 粒子组移植瘤生长速度明显较对照组缓慢并在实验第 6 天后肿瘤体积处于平台期，在实验最后阶段，相对肿瘤体积有下降趋势，而对照组裸鼠皮下移植瘤相对肿瘤体积一直生长（表 1、图 1）。经计算所得，相对肿瘤增殖率 T/C（%）125I 放射性粒子组为 23.13%，治疗有效。

图 1 裸鼠皮下结肠癌相对肿瘤体积（RTV）（%）Figure 1 The relative tumor volume (RTV) of nudemice transplantated tumor (%)

2.3 两组裸鼠经免疫组化染色 Brdu 标记指数（LI）

治疗 27 d 后肿瘤的 Brdu 标记指数（LI），经t 检验，125I 粒子组与对照组比较有显著性差异（P ＜ 0.05），125I 粒子组裸鼠皮下移植瘤的 LI 明显比对照组的低，说明移植瘤增殖率低，见表 2。125I 粒子组裸鼠肿瘤组织经免疫组化染色显示褐色的增殖细胞比对照组明显减少，说明增殖率较低，见图 2。

表 2 裸鼠皮下移植瘤 Brdu 标记指数（LI）Tabel 2 The Brdu-LI of nudemice transplantated tumor

图 2 裸鼠肿瘤组织经免疫组化染色结果 × 400（褐色深染细胞为 Brdu 标记的细胞，反映细胞的活跃程度。A：对照组；B：125I 粒子组）Figure 2 The result of tumor organization by immunochemistry ABC method × 400. Brown cell are marked by Brdu, to reflect the activity of cell. A: Control group; B: Iodine-125 particle group.

3 讨论

裸鼠是一类先天性胸腺缺陷的小鼠，T 细胞发育受阻，导致 T 细胞介导免疫缺陷，接种异体组织或细胞时，不发生排斥反应，从而可以建立人结肠癌肿瘤模型。针对大肠癌的临床研究报道较少，基础性研究报道相对更少[5]。本研究选用人Colo205 型结肠癌细胞为研究对象，考虑到结肠癌细胞来源于人原发性结肠癌，同源性强，与临床的结肠癌具有相似性，能从一定方面反映临床大肠癌治疗的疗效，为中晚期大肠癌的综合治疗方法提供实验依据。

到 20 世纪 80 年代末，125I 已成为国外近距离放射治疗中最常应用的标准核素[6]，在我国研究时间相对较短，2001 年，125I 粒子通过我国药品监督管理局批准，正式进入临床使用，是将125I 放射性元素密封于钛合金内，制作成粗细只有 0.08 cm、长不到 0.5 cm 的小短棒。微型粒子发散出持续低能量的 X 线（27.4 ～ 31.5 keV）和 γ 射线（35.5 keV），辐射半径 1.7 cm，半衰期约为 60 d。放射性粒子植入肿瘤体内后，其剂量分布并非按照距离平方反比衰减，而是在很短的距离发生陡降[7]，对肿瘤周围的组织及脏器的放射性损伤较小。

放射线在 DNA 分子中造成的破坏是由于光子能量直接作用于DNA 链，或间接地通过与放射分解所产生的游离基团（包括羟基、水合电子 e、氢原子及过氧化氢等）相互作用所产生的多种糖和碱基的病变。DNA 碱基的破坏也很常见，它在产生突变中起重要作用，从而有效控制肿瘤细胞的再增殖、再修复，截断肿瘤细胞扩散的途径，从而使肿瘤的体积减小并逐渐治愈。Kim[8]研究认为：在连续照射过程中，肿瘤细胞损伤效应累积，进而抑制细胞繁殖。增殖期细胞被杀伤后，处于非增殖期和细胞周期 G0 期的细胞进入敏感的 G2/M 期，持续不间断地照射，乏氧细胞再氧合，增加放射敏感性，如果细胞死亡超过了细胞新生，肿瘤体积就变小了。

本实验研究结果提示125I 粒子在裸鼠皮下结肠癌的治疗过程中，肿瘤生长速度较对照组缓慢，随着治疗时间的延长，经绘制相对肿瘤体积生长曲线可以看出，对照组裸鼠皮下结肠癌相对肿瘤体积曲线逐渐远离125I 粒子组，125I 粒子组、对照组肿瘤经治疗后 27 d 相对肿瘤体积经过统计分析，125I粒子组皮下结肠癌移植瘤的相对体积明显比对照组要小，考虑125I 放射性粒子植入肿瘤体内，发射出的 γ 射线直接作用于 DNA 双链，使其直接断裂或破坏碱基，从而有效地控制了肿瘤细胞的再增殖、再修复，截断了肿瘤细胞扩增的途径。同时本文结果显示在125I 粒子植入后第 6 天治疗组相对肿瘤体积（RTV）处于平台期，于第 20 天左右时，治疗组 RTV 有下降趋势，提示125I 粒子在肿瘤内的持续放射剂量累积到一定量值时才出现放射治疗效应，见图 1。

Brdu在 DNA 合成期（S 期）竞争性结合到DNA 的双链中，经免疫组化染色检测肿瘤细胞Brdu 标记指数（LI），反映肿瘤的增殖率，本文结果显示125I 粒子组裸鼠皮下结肠癌增殖率均较对照组为低，有显著性差异，再次证明了125I 放射性粒子对结肠癌细胞增殖有明显的抑制作用，考虑本实验研究采用人大肠癌细胞，可以为临床的大肠癌综合治疗提供一定的实验依据。

本实验研究结果提示：①人 Colo205 型结肠癌模型是放射性粒子植入治疗大肠癌基础研究的良好模型之一；②125I 放射性粒子对人结肠癌细胞增殖有明显的局部抑制作用；③125I 放射性粒子在体内累积一定剂量才会逐渐显现治疗效应。

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[8] Kim NK. Recent progress in diagnosis and treatment of rectal cancer. Korean J Gastroenterol, 2006, 47(4):245-247.

ObjectiveTo observe the therapeutic effect and the therapeutic mechanism of Iodine-125 radioactive particle interstitial irradiation on the nudemice transplantation tumor of human Colorectal cancer cell.

MethodsTo establish colon cancer model with human Colo205 colon cancer cells. When the diameter of transplant tumor is about to 0.8 cm, totally 20 male nudemice will be divided into two groups randomly: control group, Iodine-125 radioactive particle group. Measure the tumor volume twice per week. After 27 days treatment, the nudemice will be put to death at 6 hours before the Brdu injected into abdominal. Calculating the relative tumor volume (RTV), relative tumor Proliferation rate (T/C). Take the tissue of tumor, they will be detected by immunohistochemistry ABC method.

Results After the treatment, all of the nudemice were alive. The RTV of the treatment group is 251.59 ± 72.24, the RTV of the control group is 1087.94 ± 510.72, the difference of the treatment group compared with the control group was significal (P ＜ 0.05), tumor volume reduced obviously and growth velocity was inhibited.

Conclusions ①Human colon cancer model is a succeful model for Iodine-125 radioactive particle interstitial irradiation on the experimental study of colorectal cancer; ②Iodine-125 radioactive particle is safe, effective, feasible measure to malignant tumors;③Iodine-125 radioactive particle will reacts the effect after getting adequated dose in humor body.

【Key words】Colonic neoplasms; Iodine radioisotopes; Rats, nude; Disease models, animal

Author Affiliations:Office of Quality Control, The Central Hospital of Handan City, Handan 056001, China (REN Li-bin); Department of General Surgery and Surgical Oncology, China Meitan General Hospital, Beijing 10028, China (ZHOU Zheng, DU Yun-feng, XU Jian-hua); Beijing Cotimesbiotechnology Co., Ltd., Beijing 100176, China (SHEN En-yun); Department of Graduate, North China Coal Medical University, Tangshan 063000, China (WANG Xian-bin, GAO Xu)

Correspoding Author:ZHOU Zheng, Email: zhzh0386_cn@sina.com www.cmbp.net.cn

Chin Med Biotechnol, 2010, 5(6):434-437

作者单位：056001 邯郸市中心医院质管办（任利彬）；100028 北京，煤炭总医院普外肿瘤科（周正、杜云峰、许建华）；100176 北京同为时代生物技术有限公司（沈恩允）；063000 唐山，华北煤炭医学院研究生部（王仙斌、高旭）

通讯作者：周正，Email：zhzh0386_cn@sina.com

收稿日期：2010-06-01

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.06.007

An experimental study on nudemice transplantation tumor of human colorectal cancer cell with iodine-125 radioactive particles

REN Li-bin, ZHOU Zheng, DU Yun-feng, XU Jian-hua, SHEN En-yun, WANG Xian-bin, GAO Xu

【Abstract】