大鼠钙结合蛋白S100A9基因克隆、表达及纯化研究

尹磊淼，宋凯，张庆华，魏颖，王宇，徐玉东，杨永清

·论著·

大鼠钙结合蛋白S100A9基因克隆、表达及纯化研究

尹磊淼，宋凯，张庆华，魏颖，王宇，徐玉东，杨永清

目的构建大鼠钙结合蛋白 S100A9 的原核表达质粒并获得纯化重组蛋白。

钙结合蛋白质类； 遗传载体； 基因表达；自身免疫性疾病

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2010, 5(6):405-409

S100A9 是钙结合蛋白 S100 家族重要成员之一，功能作用广泛，可高选择性、高亲和性结合Ca2+、Zn2+等离子，具备细胞外和细胞内调节活性，参与细胞迁移，花生四烯酸代谢，骨髓细胞成熟等生物学过程[1]。S100A9 和多种免疫性炎症疾病密切相关，如支气管哮喘、系统性红斑狼疮、儿童幼年特发性关节炎、大细胞性动脉炎、多发性硬化等。我们课题组利用基因表达序列分析技术（serial analysis of gene expression，SAGE）发现 S100A9 是支气管哮喘特异性高表达标签之一[2-3]，而针刺治疗后表达降低，故认为 S100A9 可能参与针刺抗哮喘固醇合成和免疫调节等生物过程[4]。

本研究克隆构建 pET-32a-S100A9 原核表达载体，转化至 E.coli BL21(DE3) 受体菌，利用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG）和不同温度条件诱导表达重组蛋白并采用亲和层析法进行蛋白纯化，从而为进一步观察S100A9 蛋白生物学功能提供重要研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器 P100 PCR 仪为美国 Bio-Rad公司产品；Tanon Gis-2010 型数码凝胶图像处理系统、Tanon EPS300 电泳系统为上海天能科技有限公司产品；THZ-03M1 空气浴恒温振荡器为上海申能博彩生物科技有限公司产品；LRH-150 生化培养箱为上海一恒科学仪器有限公司产品；超净工作台为上海一恒科学仪器有限公司产品；Soniprep 150超声破碎仪为日本 Sanyo 公司产品；离心超滤管为美国 Millipore 公司产品；高速落地离心机为美国 Beckman Coulter 公司产品。

1.1.2 主要试剂 原核表达载体质粒 pET32a购自美国 Novagen 公司；E.coli BL21(DE3) 受体菌购自美国 Invitrogen 公司；离心柱型 PCR 产物割胶回收纯化试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司；离心柱型质粒小量制备试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司；胰蛋白胨和酵母提取物购自英国Oxoid 公司；100 mg/ml 氨苄青霉素、IPTG 均购自天根生化科技有限公司；Chelating Sepharose Fast Flow 纯化柱购自美国 GE healthcare 公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因 S100A9 的扩增 根据美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）Genebank 数据库中大鼠S100A9 基因 mRNA 序列（登录号为 NM053587）设计扩增引物。上游引物为 5’ AATGGATCCATGGCTGCCAAAACAGGAT 3’（下划线为 BamH I 酶切位点），下游引物为 5’ AATCTCGAGCTTCCCAC AGCCTTTGC 3’（下划线为 Xho I 酶切位点）。以正常大鼠肺组织 cDNA 为模板，PCR 扩增反应条件为：总量 20 μl 的反应体系于 94 ℃ 预变性 5 min，94 ℃ 变性 30 s，58 ℃ 退火 30 s，72 ℃延伸 60 s，共进行 35 个循环，最后 72 ℃ 延伸5 min。扩增产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定，然后割胶回收 S100A9 基因扩增产物。

1.2.2 重组质粒载体的构建 将 S100A9 基因回收纯化产物和原核表达载体 pET32a 质粒分别用 BamH I 和 Xho I 内切酶进行双酶切，运用T4 DNA 连接酶进行连接，16 ℃ 过夜，得到重组质粒 pET-32a-S100A9。42 ℃ 热激法转化入 E.coli BL21(DE3) 感受态细菌。在含氨苄青霉素的平板上挑选单克隆菌落并利用菌落 PCR 进行验证。

1.2.3 序列分析和同源性比较 挑选上述验证成功的阳性克隆，小量提取质粒并测序。测序结果利用 GenBank 数据库进行局部相似性基本查询工具（basic local alignment search tool，BLAST）比对分析，以验证测序结果的正确性。

1.2.4 蛋白诱导表达和纯化 取测序正确的S100A9 克隆，利用 IPTG 和不同温度诱导表达。聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳鉴定表达结果。选取可表达融合蛋白的细菌进行扩大培养，采用Ni2+固相化螯合 Sepharose Fast Flow亲和层析纯化。配置咪唑浓度梯度为 10 mmol/L、25 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、250 mmol/L、500 mmol/L洗脱重组蛋白，将不同浓度洗脱下来的蛋白分开收集，SDS-PAGE 电泳鉴定表达结果。选取上一步中蛋白纯度高的收集管，用离心超滤管浓缩蛋白，以6 mol/L 尿素脱盐去除咪唑。

2 结果

2.1 S100A9 基因 PCR 扩增

PCR 扩增产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳显示扩增得到了 1 个约为 339 bp DNA 片段，分子量大小和预期相同，提示扩增成功（图 1）。

图 1 S100A9 基因 PCR 产物Figure 1 PCR product of S100A9

2.2 S100A9 菌落 PCR 结果

S100A9 基因 PCR 产物经割胶纯化后克隆重组到 pET32a 表达载体上，挑取单克隆菌落进行菌落 PCR 扩增（采用 T7 和 T7 terminator 通用引物）并用 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定。阴性重组表达质粒由于无目的基因片段插入，通用引物之间距离大小仍为 754 bp，阳性重组表达质粒则由于S100A9 基因片段插入而扩大至约 1090 bp（插入基因分子量大小和 S100A9 相同，黑色箭头标记处），提示基因克隆重组成功（图 2）。

图 2 S100A9 菌落 PCR 结果Figure 2 Colony PCR result of S100A9

2.3 S100A9 基因测序结果

利用 BLAST 比对，提示 S100A9 基因测序结果和 NCBI Genebank 数据库中大鼠 S100A9 mRNA 序列完全一致，提示克隆序列正确（图 3），可以进行下一步蛋白诱导表达。

图 3 S100A9 基因测序结果 BLAST 比对图Figure 3 BLAST comparison of S100A9 between result of squencing and mRNA sequence of NCBI

图 4 pET-32a-S100A9 融合蛋白诱导表达图Figure 4 IPTG-induced protein expression of pET-32a-S100A9 plasmid

2.4 S100A9 蛋白在不同温度下的诱导表达和纯化

将构建的 pET-32a-S100A9 原核表达载体分别在 21 ℃、25 ℃、37 ℃ 诱导表达（IPTG 终浓度均为 1 mmol/L）。S100A9 分子量大小为 13 kD，在 pET32a 载体上表达的融合蛋白分子量大小为32 kD（pET32a 空载诱导表达为 19 kD，在此做阴性对照）。经过不同温度梯度摸索，发现 S100A9 蛋白在 21 ℃ 有比较强的表达（黑色箭头标记处，图 4）。亲和层析纯化蛋白，在 100 mmol/L 洗脱液中获得大量纯化 S100A9 重组蛋白（图 5）。Lowry法测蛋白浓度为 8.01 mg/ml。

图 5 S100A9 纯化蛋白电泳图Figure 5 Electropherogram of S100A9 purified ptotein

3 讨论

S100A9 参与多种细胞调节机制和信号传导过程，如细胞生长、分化、增殖、凋亡等[5]。该蛋白主要功能是抑制酪蛋白激酶 I 和 II 活性，而近年研究发现在免疫性炎症、肿瘤、疼痛等疾病中均出现 S100A9 高表达，包括囊性纤维化、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病、肺脏鳞癌等[6-7]，提示 S100A9 有可能作为临床疾病诊断新指标。S100A9 还能通过二聚体金属螯合作用降低 Mn2+和 Zn2+浓度，从而抑制金黄色葡萄球菌（S.aureus）生长[8]。

S100 蛋白家族成员广泛参与调控蛋白磷酸化、钙离子自稳态调节、细胞骨架动态平衡以及细胞增殖和分化[9]，是新药靶标候选蛋白之一。S100A9 能与喹啉-3-甲酰胺小分子特异性结合，在控制自身免疫性疾病过程中起重要作用，被认为是一个新的用于治疗人类自身免疫性疾病药物靶标[10]。Yohannes 等[11]通过双向电泳发现 S100A9蛋白在糖尿病膀胱功能异常并发症中差异表达升高，可能和平滑肌收缩功能及炎症相关，是治疗该病潜在靶标。Moon 等[12]通过基因表达谱发现S100A8 和 S100A9 基因是乳腺上皮细胞新陈代谢功能状态候选标志物，可作为乳腺癌治疗和预后潜在靶标。

S100A9 蛋白分子量较小，在胞质中表达时主要以可溶性形式存在，容易被胞内蛋白酶降解，活性不够稳定，因此分离纯化比较困难。本实验采用带有融合蛋白的 pET32a 原核表达载体，连接和转化效率非常高，性能稳定，特别适用于小分子蛋白基因克隆及表达研究。其次，温度是影响蛋白原核表达效率和产量的重要因素之一。在基因测序证实S100A9 克隆序列正确后，优化实验条件，在不同温度下诱导表达 S100A9 蛋白，发现在 21 ℃ 该蛋白有较大表达量。本研究最终利用 pET32a 原核表达载体上的 6 × His-Tag 序列进行亲和层析纯化，获得大量重组蛋白。

S100A9 目前在国内研究较少，尚处于起步阶段。随着研究工作深入，它在疾病中的作用机制将会愈加清晰。S100A9 纯化蛋白的获得将为今后进一步研究其生物学功能奠定坚实基础。

[1] Carafoli E, Brini M. Calcium signalling and disease. New York: Springer, 2007:93-138.

[2] Yin LM, Jiang GH, Wang Y, et al. Serial analysis of gene expression in a rat lung model of asthma. Respirology, 2008, 13(7):972-982.

[3] Yin LM, Zhang QH, Wang Y, et al. Validation of the libraries of the serial analysis of gene expression by the application of real-time quantitative polymerase chain reaction. Acta Acad Med Sinicae, 2010, 32(1):11-14. (in Chinese)尹磊淼, 张庆华, 王宇, 等. 基因表达连续分析标签数据库的实时定量多聚酶链反应验证. 中国医学科学院学报, 2010, 32(1):51-54.

[4] Yin LM, Jiang GH, Wang Y, et al. Use of serial analysis of gene expression to reveal the specific regulation of gene expression profile in asthmatic rats treated by acupuncture. J Biomed Sci, 2009, 16:46.

[5] Cheng P, Corzo CA, Luetteke N, et al. Inhibition of dendritic cell differentiation and accumulation of myeloid-derived suppressor cells in cancer is regulated by S100A9 protein. J Exp Med 2008, 205(10):2235-2249.

[6] Wilkinson MM, Busuttil A, Hayward C, et al. Expression pattern of two related cystic fibrosis-associated calcium-binding proteins in normal and abnormal tissues. J Cell Sci, 1988, 91(Pt 2):221-230.

[7] Wulffraat NM, Haas PJ, Frosch M, et al. Myeloid related protein 8 and 14 secretion reflects phagocyte activation and correlates with disease activity in juvenile idiopathic arthritis treated with autologous stem cell transplantation. Ann Rheum Dis, 2003, 62(3):236-241.

[8] Corbin BD, Seeley EH, Raab A, et al. Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses. Science, 2008, 319(5865):962-965.

[9] Donato R. Intracellular and extracellular roles of S100 proteins. Microsc Res Tech, 2003, 60(6):540-551.

[10] Björk P, Björk A, Vogl T, et al. Identification of human S100A9 as a novel target for treatment of autoimmune disease via binding to quinoline-3-carboxamides. PLoS Biol, 2009, 7(4):e97.

[11] Yohannes E, Chang J, Christ GJ, et al. Proteomics analysis identifies molecular targets related to diabetes mellitus-associated bladder dysfunction. Mol Cell Proteomics, 2008, 7(7):1270-1285.

[12] Moon A, Yong HY, Song JI, et al. Global gene expression profiling unveils S100A8/A9 as candidate markers in H-ras-mediated human breast epithelial cell invasion. Mol Cancer Res, 2008, 6(10):1544-1553.

Cloning, expression and protein purification of rat calcium-binding protein S100A9

YIN Lei-miao, SONG Kai, ZHANG Qing-hua, WEI Ying, WANG Yu, XU Yu-dong, YANG Yong-qing

ObjectiveTo construct the prokaryotic expression plasmid of rat calcium-binding protein S100A9 and obtain purified recombinant protein.MethodsBased on the mRNA sequence of rat calcium-binding protein S100A9, PCR primer pair were designed. The gene wasamplified and inserted into pET32a prokaryotic expression vector. After confirmatory sequencing, expression of S100A9 protein was induced by isopropy-β-D-thiogalactoside (IPTG) at different temperatures. The protein was then identified by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and purified by affinity chromatography.ResultThe results of PCR and the sequence of recombinant plasmims pET-32a-S100A9 were consistent to the expected ones. SDS-PAGE and western blotting showed that the relative molecular weight of the expressive product was same to the expected value. The affinity chromatography purification obtain mg grade purification, and found that the recombinant proteins in the 21 ℃proteins have a strong expression.ConclusionThis study has laid a foundation for further research of biological function of S100A9.

Calcium-Binding proteins; Genetic vectors; Protein expression; Autommune disease

国家自然科学基金（81001548，30873299，30701123）；上海市教委和上海市教育发展基金会“晨光计划”资助项目（10CG45）；上海市卫生局青年基金（2009Y096）；上海高校优秀青年教师科研基金（szy09022）；上海市重点学科建设项目（S30304）

200030，上海中医药大学上海市针灸经络研究所（尹磊淼、魏颖、王宇、徐玉东、杨永清）；201203 上海，生物芯片上海国家工程研究中心（宋凯、张庆华）

杨永清，Email：dryqyang@163.com

2010-09-16

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.06.001

方法根据大鼠 S100A9 基因 mRNA 序列，设计 PCR 引物，常规扩增后重组连入原核表达载体 pET32a，并进行序列测定。利用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）和不同温度诱导表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定结果，并亲和层析纯化重组蛋白。

结果PCR 扩增获得的条带与预期的 DNA 表达片段大小一致，克隆构建了 pET-32a-S100A9 原核表达载体，测序结果与预期完全一致，经亲和层析纯化获得毫克级纯化重组蛋白，并发现该蛋白在 21 ℃ 有比较强的表达。

结论为进一步探讨 S100A9 蛋白生物学功能奠定基础。

Author Affiliations:Shanghai Research Institute of Acupuncture and Meridian, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200030, China (YIN Lei-miao, WEI Ying, WANG Yu, XU Yu-dong, YANG Yong-qing); Shanghai National Engineering Center for Biochip, Shanghai 201203, China (SONG Kai, ZHANG Qing-hua)

Correspongding Author: YANG Yong-qing, Email: dryqyang@163.com www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2010, 5(6):405-409