海洋微生物活性物质分离提取方法研究进展

张奕婷，迟海洋，张丽霞，祖国仁

(1.大庆师范学院 生命科学学院，黑龙江 大庆 163712；2.广东食品药品职业学院 国际学院，广东 广州 510520；3.大连工业大学 生物与食品工程学院，辽宁 大连 116034)

海洋覆盖着地球表面积的71%，是生命的发源地，生物种类20多万种，其生物量约占地球生物量的87%，其生物多样性远远超过陆地生物的多样性。可以说海洋是地球上最大的资源能源宝库。海洋环境条件恶劣，具有高盐、高压、低温、低光照、寡营养、低溶氧等特点，为了适应这样的生存环境，海洋生物在新陈代谢、生存繁殖方式和适应方式等方面产生了与陆地生物不同的代谢系统和机体防御系统。因此在海洋生物及其代谢产物中发现了许多具有特异、新颖、多种多样化学结构的生物活性物质，包括抗肿瘤化合物、肿瘤促进剂、抗炎症/过敏化合物、抗菌、抗病毒化合物、生物毒素、抗寄生虫化合物、多不饱和脂肪酸等，其中相当部分生物活性物质是陆地生物所没有的[1]。这些海洋生物活性物质具有种类繁多、结构特异及活性强等特点，再加上目前陆地资源的不断开发，发现新的代谢物的可能性日趋减少，带来了对新的生物来源的强烈需求，有关海洋生物活性物质的研究已经引起国内外的重视。海洋天然产物的特异结构和药理作用是陆源生物所无法比拟的，海洋药物具有显著的药理稳定性和强效性，毒副作用相对较小，对防治癌症、艾滋病、心脑血管病、老年病等疑难病症具有独特效应，已成为开发新药、特药的主要方向之一。

随着海洋生物活性物质的研究不断加强，海洋微生物的研究开发也受到世界瞩目。海洋微生物有产生生物活性物质的巨大潜力，目前发现的许多海洋生物活性物质都分离自海洋微生物，并且发现以前有些被认为是海洋动植物产生的生物活性物质实际上是由与动植物宿主共生的微生物所产生。因此,海洋微生物生物活性物质的研究已成为开发海洋资源的重要内容之一。

1 海洋微生物的定义及其种类

目前，关于什么是真正的海洋微生物仍有争议。一般认为，分离自海洋环境，其正常生长需要海水，并可在寡营养、低温条件下生长的微生物即可视为严格的海洋微生物。然而，有些分离自海洋的微生物，其生长不一定需要海水，但可产生不同于陆地微生物的代谢物(如溴代化合物抗生素)或拥有某些特殊的生理性质(如盐耐受性、液化琼脂等)，也被视为海洋微生物[2]。这些微生物中不仅包括海洋中生物起源的种类，而且还包含陆地起源后流入海洋中并适应了的微生物种类，几乎包括了所有的微生物种类[2]。如病毒等非细胞类生物、以产甲烷细菌和嗜盐细菌为代表的古细菌、陆地环境常见的细菌种类以及种类繁多的真核微生物。

2 海洋微生物产生的生物活性代谢产物

有关海洋微生物产生生物活性代谢产物的大量研究工作在20世纪60年代以后展开，现已知的海洋微生物所产生的生物活性物质种类包括新型抗生素、抗癌药物、不饱和脂肪酸、酶、酶抑制剂、维生素、毒素等，还有不少海洋微生物代谢物结构新颖，但其功能还有待开发。其中对于海洋微生物产生的多糖类物质和酶的研究比较深入。

2.1 海洋微生物多糖

近二十年来，由于分子生物学的发展，人们渐渐认识到糖及其复合物分子具有极其重要的生物学功能。多糖是构成生物体的一类十分重要的有机化合物，与免疫功能的调节、细胞间的识别、细胞间物质的运输等都有着密切的关系，是生命的物质基础。多糖的种类各异，在生物体中行使着不同的功能。人们逐渐发现多糖具有许多方面的生物活性，且多数无毒，可以成为理想的药物来源。近年来，随着海洋药物和海洋保健生物制品的蓬勃发展，海洋多糖类物质的研究引起了广泛重视，经科研和实践证明，海洋多糖及其降解产物具有多种新型的生理活性，在医药、化妆品、食品工业及农业等方面具有重要的应用价值。

2.2 海洋微生物酶

海洋微生物酶的开发和利用是实现海洋资源高值化的关键技术之一。海洋生态环境的复杂使得海洋微生物的遗传结构和生理习性发生适应性的改变，从而产生出具有独特生理活性的酶系。利用从海洋微生物中分离提取的多糖降解酶对海洋生物多糖进行降解，得到具有新型生物活性的低聚糖组分，并逐渐发展到海洋多糖降解酶及其酶解产物的工业化生产，将会有效地推动海洋多糖活性物质的开发和利用，从而产生巨大的经济效益和社会效益。

2.2.1 几丁质(壳聚糖)降解酶

几丁质是广泛分布于自然界的生物多聚物。几丁质及壳聚糖经水解后得到的寡糖具有多种生理功能，如改善肠道微生物区系，促进肠道有益微生物的生长，降低血液胆固醇含量，提高机体免疫功能等。因此，几丁质和壳聚糖的降解尤其是酶法降解成为近期人们关注的热点。酶法降解包括专一性酶解法和非专一性酶解法，前者是利用从细菌、真菌及某些动植物体内提取的几丁质(壳聚糖)酶对底物进行专一性降解。

在海洋中，由于浮游生物在生长过程中进行规律性的换壳，形成大量的几丁质，为几丁质降解微生物的生长繁殖提供了丰富的碳源和能源。到目前为止，已发现能够产生几丁质酶和壳聚糖酶的细菌包括:粘细菌(Myxobacter)、生孢噬细菌属(Sporocytophaga)、芽孢杆菌属(Bacillus)、弧菌属(Vibrio)、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙雷氏菌(Serratia)、色杆菌属(Chromobacterium)、梭菌属(Clostridium)、黄杆菌属(Flavobacterium)等；放线菌,如节杆菌属(Arthrobacter)、链霉菌属(Streptomyces)等;真菌如曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、根霉属(Rhizopus)等。

2.2.2 褐藻胶降解酶

褐藻胶存在于海带等褐藻细胞间质中。褐藻胶酶可以水解甘露糖醛酸和古罗糖醛酸残基间的1，4糖苷键，其主要来源是海洋中的微生物和食藻的海洋软体动物如海螺、鲍鱼等。褐藻胶产生菌包括弧菌、黄杆菌(Flavobacterium multivolum)、固氮菌(Azotobacte vinelandii)、克雷伯氏菌(K.aerogenes、K.pnermoniae)、假单胞菌(P.alginovora、P.aeruginosa)、肠杆菌(E.cloacae)、别单胞菌、芽孢杆菌等。早在1934年，Waksman就从海水和海底沉积物以及藻体上分离到能降解褐藻胶的菌种。

多年的科研和实践证明,褐藻多糖具有多种生理活性和广泛的应用价值,而酶解得到的低分子片段,在医疗保健等方面的多种功效的逐渐认识,更是成为人们关注的焦点.分子量小于1000的褐藻胶寡糖可作为人表皮角质化细胞的激活剂,聚合度1～9的寡聚甘露糖醛酸或古罗糖醛酸可用于制作矿物吸收促进剂。另外，人们还发现褐藻胶寡糖对植物的生长具有促进作用，在化工行业也有一定的应用价值。褐藻胶酶还可作为海藻解壁酶的组成部分，可用于海藻的细胞解离，以获得其单细胞和原生质体。

2.2.3 琼胶降解酶

琼胶是一种亲水性红藻多糖，包括琼脂糖和硫琼胶两种组分。琼胶降解形成的低聚糖产物可作为功能性食品和药品的原料或添加剂，近年来在日用化工领域又发现琼胶寡糖的一些新用途，日本利用琼胶寡糖作为添加剂生产的化妆品对皮肤具有很好的保湿效果，对头发也有很好的调理效果。

降解琼胶的酶可以从微生物和一些软体动物中分离得到，如黑指纹海兔(Aplysiadactylomela)、鲍(Haliotiscoccinea)、滨螺(Littorinastriata)、冠海詹(Diademaantillarum)等。琼胶降解菌主要存在于海洋环境中，这些降解菌可分为两类：一类菌软化琼胶，在菌落周围出现凹陷；另一类菌则剧烈地液化琼胶。潮汐带淤泥中含有的琼胶降解菌可达107/g,大约占淤泥中所有好氧细菌的2%～4%。自从1902年Gran第一次从海水中分离到琼胶的分解细菌——假单胞菌(P.galatica)以来，人们已经从海洋环境中分离到多种琼胶分解菌，包括：噬细胞菌属(Cytophage)、芽孢杆菌属、弧菌属、别单胞菌属、假别单胞菌属(Pseudoalteromonas)及链霉菌属等。

2.2.4 纤维素降解酶

纤维素为自然界第一大糖，人们很早就知道细菌和霉菌能够降解纤维素，直至1912年，Pringsheim才从耐热性纤维素细菌中分离出纤维素酶。纤维素酶可用于生物纺织助剂，棉麻产品的磨洗等后处理，用于海藻解壁及生物肥料加工等。随着海藻工业的迅猛发展，大量的海藻加工废弃物产生并排放到环境中，造成极为严重的环境污染问题，利用纤维素酶降解海藻加工废弃物，得到易被植物吸收利用的低聚分子片段，制成生物肥料，同时解决了环保问题。利用细菌、放线菌、真菌对自然环境中的野生植物和废弃纤维素产品进行降解再利用，可以生产乙醇、糠醛等各种工业产品，同时还可以回收大量的微生物单细胞蛋白。Takashi Yamasaki等人利用紫菜粉或木聚糖分离到275株细菌，包括黄杆菌、别单胞菌、不动杆菌属(Acinetobacter)和弧菌，它们具有多种糖苷酶活性，能够降解紫菜等海藻的细胞壁多糖，包括木聚糖、紫菜多糖、甘露聚糖和纤维素，得到紫菜细胞的原生质体。

3 海洋微生物生物活性代谢产物的分离和提取

海洋微生物产生的天然代谢产物主要包括：多糖、多肽、脂肪酸、皂甙、萜类、大环聚酯类、聚醚类等化合物，具有结构复杂、多样性、高生物活性等突出特点。因此海洋生物活性物质的筛选、提取、纯化是一项十分困难的工作，用传统的化学方法难以实现，比如多糖类物质。多糖是极性大分子化合物，大多采用不同温度的水、稀碱溶液提取，尽量避免在酸性条件下提取，以防引起糖苷键的断裂，稀酸提取时，时间宜短、温度不宜超过50℃。

3.1 萃取技术

传统的液—液萃取分离技术成本比较低、易于运作，已广泛应用于多组分物质的分离。但由于溶剂的局限性，难于分离大分子生物活性物质。近年来，一些新的萃取技术显示了良好的应用前景。

3.1.1 超临界流体萃取技术

超临界流体萃取技术是以超临界状态下的流体为溶剂，利用该状态下的流体所具有的高渗透能力和高溶解能力分离混合物的过程。超临界流体是温度与压力均在其临界点之上的流体，性质介于气体和液体之间，由于液体相接近的密度，与气体相接近的黏度及高的扩散系数，故具有很高的溶解能力及良好的流动、传递性能，可代替传统的有毒、易燃、易挥发的有机溶剂。

最常用的超临界流体二氧化碳，由于具有临界条件温和、对大部分物质呈化学惰性、无色无味无毒、物溶解污染、易制成高纯度气体，不易点燃等优点，特别适用于热敏性、易挥发、易氧化成分的分离萃取，已经被广泛使用。现在可利用超临界萃取技术分离提取的海洋活性物质有海洋生物毒素、萜类化合物、海洋天然色素、某些稀有氨基酸等。

3.1.2 反胶束萃取技术

双亲物质(表面活性剂)溶于非极性有机溶剂，当浓度大于临界胶团浓度时，在有机相中会自发形成聚集体，成为反胶束。反胶束中极性头朝内，非极性头朝外形成亲水内核，可以增溶水、蛋白质等极性物质。近年来，该技术和其他方法结合，如亲和配体的引入、超临界流体萃取技术的联用以及分离萃取工艺设备的完善，大大提高了目标物的萃取率和分离的选择性，拓展了该技术的应用空间，可以预见它在海洋微生物生物活性产物方面的研究和开发及海洋生物制药方面有良好的应用潜力。

3.2 膜分离技术

膜分离是用天然或人工合成的高分子薄膜以外界能量或化学位差为推动力,对双组分或多组分的溶质进行分离、分级、提纯和浓缩的过程。膜分离过程在常温、无相变、无化学变化条件下实现对物质的分离，是一项有效、节能、无污染、保持原料性能不变的物质分离技术。近年来，微滤、超滤及反渗透等各种膜分离技术发展迅速，以广泛应用于制药、生物化工、食品、环保等方面，在天然活性物质的提取和海洋药物的研制中更显现出其技术优势。

3.2.1 纳滤

纳滤膜是20世纪80年代末问世的一种新型分离膜，其截留分子量介于反渗透和超滤膜之间。该膜存在着纳米级细孔，截留率大于95%的最小分子的直径约为1nm。与反渗透和超滤等膜分离过程一样，纳滤也是以压力差为推动力的膜分离，其分离机理可以运用电荷模型、细孔模型及静电排斥和立体阻碍模型等来描述。

利用纳滤膜的电荷性，可以用来分离肽类活性物质。多肽分子含有游离的羧基和氨基，等电点时呈电中性，当溶液的pH值高于或低于等电点时，多肽分子则呈阴离子或阳离子形式，带有相应的正电荷或负电荷。利用带有静电官能基团的纳滤膜，只要通过调节溶液的pH，就可以截留离子而不截留电中性的分子。此特性可以分离分子量几乎相差无几，但等电点相差较大的多肽混合体系。同时选择适合的纳滤膜还可以从低聚糖混合溶液中有效的除去单糖、二糖等[4]。

3.2.2 亲和—膜过滤

亲和—膜过滤是生物分子的亲和相互作用原理与膜分离技术相结合的新型耦合分离技术。当需提纯物质(亲和体)自由存在于提取液时，由于其分子量相对比较小，能顺利地通过截留相对分子量大的超滤膜。但当亲合体与具有结合能力的大分子配体混合形成亲和体大分子复合物后，由于此复合体的分子量远大于超滤膜的截留相对分子量，从而被截留，而提取液中其他未被结合的组分则通过超滤膜被除去。用适合的洗脱液处理超滤膜截流到的复合物，使得亲和膜过滤法既具有膜分离法易于放大、分离速度快的特点，又具有亲和层析选择性好、分离精度高的优点，在筛选分离纯化浓缩功能性蛋白质分子(酶、抗体、抗原、载体、抗生素等)有较大的应用前景。

3.3 色谱方法

色谱方法的起源、发展与天然产物的研究工作密切相关。海洋微生物活性成分多而结构复杂，有效成分的分离、纯化很困难，而色谱分离技术则是这类物质精细分离的有效手段。

3.3.1 液相色谱

液相色谱法作为一种分离手段，是根据混合物种不同组分在流动相和固定相间具有不同的分配系数，当两相做相对运动时，这些组分在两项间进行反复多次的分配，从而得到分离。液相色谱分离法是海洋天然活性物质蛋白质、多肽、多糖、低聚糖、核苷酸等的分离纯化的重要方法。特别是制备性高效液相色谱技术的出现，对海洋生物制药产生了深远的影响，它不仅可以在温和条件下段时间内达到分离目的，更重要的是易于放大，能形成生产化的制备规模。液相色谱可按溶质在两相分离过程的物理化学原理分类：

1)吸附色谱：用固体吸附剂作固定相，以不同的溶剂作流动相，依据样品中各组分在吸附剂上吸附性能的差别来实现分离。

2)分配色谱：用在固相基体上的固定液作固定相，以不同极性溶剂作流动相，依据样品中各组分在固定液上分配性能的差别来实现分离。

3)离子色谱：用高效微粒离子交换剂作固定相，以具有一定pH值的缓冲溶液作流动相，依据离子型化合物中各离子组分与离子交换剂上表面带电荷基团进行可逆性离子交换能力的差别而实现分离。

4)体积排阻色谱：用化学惰性的多孔性凝胶作固定相，按固定相对样品中各组分分子体积阻滞作用的差别来实现分离。

5)亲和色谱：以在不同基体上，键合多种不同特征的配体作固定相，用不同的pH值缓冲溶液作流动相，依据生物分子与基体上键联的配位体之间存在的特异性亲和作用能力的差别，而实现对具有生物活性的生物分子的分离。

3.3.2 高速逆流色谱

逆流色谱是一种无载体的液—液分配色谱，从古老的分液漏斗萃取法发展而来，有着回收率高、制备量大、排除载体干扰的优点。

3.3.3 超临界流体色谱

超临界流体色谱以超临界流体为流动相，必要时加入甲醇等极性物质为改性剂来改善分离性能。超临界流体色谱具有气相色谱和高效液相色谱的优点，在室温下即可分离热不稳定性、沸点较高或分子量较大的物质，同时还具有柱效高、分离速度快的特点，可用通用的灵敏检测器。

4 结语

21世纪是海洋的世纪，海洋是人类生命的巨大宝库。在过去的几十年中，人们已经从海洋环境中分离到数百种具有生理活性的化合物，其中很多属海洋环境特有的成分。然而我们对海洋微生物的研究和开发还刚刚起步，关于海洋微生物的生理结构、生活特点、代谢调控各方面还很不清楚，严重制约了人们对海洋财富的开发和利用。随着化学、生物、物理、制药等相关学科的发展和相互渗透，天然产物的分离提取技术的长足进步，对海洋微生物生物活性代谢产物的分离提取和研究提供更强有力的技术支持。

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