猪繁殖与呼吸综合征诊断方法研究进展

赵泽坤,王 娇,王金凤,张岭岭,孙继国

(河北农业大学动物科技学院,河北保定071001)

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),又称“猪蓝耳病”,主要以引起母猪的繁殖障碍以及呼吸道的症状为特征,由于PRRSV与其他引起猪繁殖障碍的疾病等引起的临床症状相似难以区分,并且由于其他细菌性疾病和病毒性疾病的继发感染,使得临床诊断更加困难,因此很难对该病做出准确诊断,必须进行病毒分离、免疫学检测以及运用分子生物学技术综合诊断才能确诊。

1 病毒分离

病毒分离是PRRS最为确切的实验室诊断方法。病毒分离最好采用死胎或弱仔猪的肺、脑、脾、血浆、血清等组织匀浆的混合物,经处理后接种于适当的细胞培养物。目前用于分离PRRSV的细胞有以下儿种:猪原代PAM,CL-2621,细胞克隆株Marc-145细胞最后又从Marc-145中克隆出更敏感的HS2H细胞用于PRRSV的分离。

PRRS发病急性期出现病毒血症,因此,急性期采样时,分离成功率较高。另外,与成年猪相比,仔猪及死胎更适宜于采样分离。但不同分离株在细胞培养上生长繁殖的情况各不相同,有些毒株在每一代细胞培养3 d～4 d即可出现CPE,但有些毒株则需在第3代或4代才出现CPE,有些分离株在敏感细胞上并不出现细胞病变。因此,在进行病毒分离的同时,还应结合相应的IFA和IPMA等方法进行鉴定。另外,还可用PCR法增殖病毒抗原,作遗传基因鉴定,从而使结果更为可靠[1]。

2 抗原检测

对PRRSV抗原的检测一般建立在特异性单抗的基础上,用全病毒抗原或多肽表达产物作为免疫原,已分别获得PRRSV N,M,GP5,GP4,GP3蛋白的特异性单抗,其中N蛋白的免疫原性最强,用全病毒免疫所获得的单抗多半是针对N蛋白上的抗原表位。这些单抗中有些是针对美洲型和欧洲型毒株上共同的保守性抗原位点,有些仅与美洲型或欧洲型毒株中的一型发生反应,合理地利用这些单抗进行检测,可以同时检出美洲型和欧洲型PRRSV,也可区分其血清型。检测抗原的方法主要包括免疫荧光染色法、免疫过氧化物酶染色法,以及免疫胶体金技术。由于猪感染PRRSV后血清抗体可长时间持续存在,且抗原检测时病料组织的处理较为繁琐,因此,血清学试验检测抗体更适宜于PRRS的疾病监测和诊断。

3 血清学方法

PRRS诊断的血清学方法也是目前诊断该病最为广泛的方法。目前可用于检测PRRS的血清学方法主要有间接免疫荧光实验(IFA)、免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、血清中和实验(SN)、酶联免疫吸附试验((ELISA)等四种。

3.1 免疫过氧化物酶细胞单层试验(IPMA)

IPMA具有较好的特异性和敏感性,是欧洲国家广泛使用的血清学诊断方法,在美洲和亚洲国家也较为常用。可用本试验检测病猪和康复后猪的双份血清中的LV抗体。这种方法特异性强,可测出感染后1周～2周至12个月的抗体,抗体效价低于100为阴性。试验主要在PAM,Marc-145,CL-2621细胞来进行,此方法特异性与敏感性较好,可以用于PRRSV的抗原检测、病毒的鉴定、血清抗体的检测。该法能在感染后6日血清中检测到抗体,但本方法需要专门的实验设施,并且容易出现假阳性,主观性较强。

3.2 间接荧光抗体试验(IFA)

IFA是美国、加拿人、日本等国广为应用的血清学检测方法,敏感性和特异性与IPMA相当,抗原制备也与IPMA法相同。IFA可检测出感染后2 d～28 d的IgM抗体,血清抗体效价低于1∶20者为阴性。Joo H S等[2]用间接荧光抗体试验检测了接种不同PRRSV毒株猪的IgG和IgM抗体反应,发现携带有IgM抗体的猪此前不久很可能受到PRRSV的感染。我国于1996年由哈尔滨兽医研究所建立了1FA检测方法。尹训南等[3]应用IFA技术对人工感染PRRSV的3日龄～30日龄健康和/或SPF仔猪体内病毒抗原或核酸的分布进行研究,从脏器的血管内皮细胞及血管内和巨噬细胞内检出了病毒抗原和核酸,此法的特异性与敏感性较好。但是,同IPMA一样,这两种方法的结果判断带有一定的主观性,且不适于大规模临床样品的检测。

3.3 酶联免疫吸附试验(ELISA)

ELISA适宜于大规模检测,方便易行,操作过程及结果判断能够标准化,且具有高度的特异性和敏感性,目前许多国家已把ELISA作为监测诊断的常规手段。另外,血清中PRRSV的ELISA抗体出现时间与IPMA和IFA抗体相当,但血清中PRRSV的ELISA抗体的持续时间明显长于IPMA和IFA抗体的持续时间。ELISA可测定感染后2周病毒抗体,当OD值大于或等于0.4时可判为阳性。

ELISA方法敏感、特异,比IPMA方法能更早的检测出抗体。间接ELISA主要用于检测血清中抗体,如PRRSV抗体,也可检测抗原。Srensen K等[4]分别用3种方法(阻断ELISA、间接ELISA,IPMA)检测PRRSV抗体,结果发现阻断ELISA的敏感性和特异性最高,与另外两种方法相比,它成本较低,更易于大面积推广。竞争性ELISA可检测抗体,Dea S等[5]成功地用该法检测出了PRRSV核衣壳蛋白的抗体。王刚等[6]用差速离心法提纯PRRSV利用NC膜作为载体,成功地建立了检测PRRSV抗体的Dot-ELISA。

用于ELISA的抗原有两种,一种是从细胞培养物中纯化的全病毒抗原,一种是重组的PRRSV核衣壳蛋白。因为Marc-145细胞抗原成分容易引起非特异性反应,所以待检的血清样品必须同时对正常的细胞抗原进行平行检测作为对照。

3.4 血清中和试验(SN)

本法主要用于检测PRRSV抗体,使用MARC-145细胞在96孔微量板上进行。传统的NT试验不能检出急性感染期的抗体,并且需用双份血清。Yoon和Takikawa等在血清和病毒混合液中加入补体,提高了反应的敏感性,可在PRRSV感染早期作出诊断[7]这种改良后的方法最早在接种后8 d即能检出NT抗体。接种11 d～21 d和41 d～45 d抗体效价较高。

4 分子生物学诊断

与血清学诊断方法相比,分子生物学诊断方法具有更高的特异性和敏感性。其方法主要包括核酸探针原位杂交技术(ISH)和RT-PCR技术。

4.1 原位杂交技术(ISH)

进行原位杂交的cDNA探针主要是针对PRRSV的ORF7设计的。ISH用于PRRSV的检测,其敏感性高于免疫组化法和免疫胶体金技术,而且检出的持续时间更长,因为PRRSV RNA在组织中的存在时间较其抗原的表达时间长。另外,根据美洲型和欧洲型PRRSV的核酸序列设计合成不同的探针可区别不同基因型PRRSV的感染,而将两种探针棍合后进行ISH,则两种基因型的感染均可检出。该方法可以在肺、淋巴结、肺泡巨噬细胞等组织感染细胞内检测到PRRSV的RNA。

4.2 RT-PCR技术

RT-PCR法PCR为80年代中期发展的一种针对微生物核苷酸新的特异性诊断技术,因具有较高的特异性和敏感性,己广泛应用病毒病诊断。RTPCR法不仅能诊断PRRSV,而且能进行不同分离株的基因鉴定。据报道,RT-PCR技术能检测出10—5TCID50病毒,故在诊断PRRS的工作中受到越来越多人欢迎。国外Christoph E等[8]建立了TaqMan RT-PCR法,对美洲毒株和欧洲毒株混合感染的群猪进行鉴别诊断。Wesley R D等[9]对ORF5的RT-PCR产物进行RFLP分析时可以区分疫苗株和野毒株。

针对2006年以来在我国发生的高致病性猪蓝耳病,田克恭等首先建立了专门针对H-PRRSV的特异性RT-PCR方法。该方法具有良好的特异性,敏感性可达到4TCID50,该方法已申请专利(申请号:200710086548.2)。目前已有各种不同的针对高致病性PRRSV的RT-PCR方法,随着技术的发展,新建立的RT-PCR、多重PCR、RTPCR-RFLP对诊断PRRSV的特异性更强,敏感性更高。不仅可用于检测各种临床样品,还可以鉴别不同基因型的毒株,区分疫苗株和野毒株。因此,RT-PCR方法无疑是一种快速、准确、灵敏的诊断方法。

5 小结

今年来,PRRS对养猪业的危害越来越严重,由于PRRSV不同分离株尤其是不同基因型(群)分离株在毒力、生物学特性、抗原性和遗传特性上存在一定差异,利用单一PRRSV毒株制备的疫苗并不能完全保护免疫猪免受异源毒株的感染,因此,对PRRSV的早期的诊断至关重要。

虽然现在已有各种不同的检测技术,但是由于在临床应用上有着各种缺陷和局限性,并且随着时代的进步,对PRRSV诊断方法的先进性、灵敏度、特异性有更高的要求,建立特异、敏感、简便、快速的诊断检测技术仍是PRRSV研究的一个重要方向。

[1] Rossow K D,Bautista E M,Goyal S M,et al.Experimental porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in one-、four-、and 10-week-old pigs[J].J Vet Diagm Invest,1994,6(1):3-12.

[2] Joo H S,Park B K,Dee S A.Indirect fluorescent antibody response of pig infected with porcine reproductive and respirtory syndrome virus[J].Vetrinary Microbiology,1997,55(124):303-307.

[3] 尹训南,郭宝清,猪生殖呼吸道综合征病毒抗原在仔猪体内定位的研究[J].中国畜禽传染病,1997(5):57-49.

[4] Srensen K,Btner A,Smedegaard J,et al.Evalution of a blocking ElISA for screening of antibodies againstporcine reproductive and respirtory syndrome(PRRS)virus[J].Veterinary Microbiology,1996,56(122):1-8.

[5] Dea S,Wilson H,Therrien M,et al.Detection of antibodies to the nucleocapsid protein of PRRS virus by a competitive ELISA[J].Adv Exp Med Bio,2001,494:401-405.

[6] 王 刚,张鹤晓,甘孟侯,等.IPMA检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的研究[J].中国兽医杂志,1996,22(10):3-5.

[7] Jusa E R,Inaba Y,Kouno M,et al.Slow reacting and complement requiring neutralizing antibody in swine infected with porcine reproductive and respiratory syndrome(PRRS)virus[J].J Vet M ed Sci,1996,58:749-753.

[8] Christoph E,Barbara T,Luzia L,et al.Quantitative TaqMan.RT-PCR for the detection and differentiation European and North American strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].J Virol M eth,2001,98(1):63-75.

[9] Wesley R D,Mengeling W L,Lager K M,et al.Differentiation of a porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccine strain from north American field strains by restriction fragment length polmorphism analysis of ORF5[J].Vet Diagn Invest,1998,10:104-144.