牛传染性鼻气管炎诊断方法研究进展*

徐晓琴,冷 雪,李真光,武 华

(中国农业科学院特产研究所人兽共患病研究室,吉林吉林 132109)

牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis,IBR)是由牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)引起的牛的一种急性、热性、接触性传染病。IBRV又称牛疱疹病毒Ⅰ型、坏死性鼻炎病毒和传染性脓疱外阴-阴道炎病毒。该病以高热、呼吸困难、鼻炎、窦炎和上呼吸道炎症为特征。还可引起生殖系统损害,出现流产和死胎以及发生肠炎和小牛脑炎等症状,有时也发生眼结膜炎和角膜炎[1]。继发性的细菌感染能导致更严重的呼吸道疾病。

1955年在美国科罗拉多州首次发现以传染性鼻气管炎症状为特征的疾病,随后出现在洛杉矶和加利福尼亚州等地,并被命名为IBR。Madin等在1956年首次从患牛中分离出病毒,随后一些研究者相继从病牛的结膜、外阴、大脑和流产胎儿分离出病毒。Huck于1964年确认牛传染性鼻气管炎病毒为疱疹病毒。本病目前在世界范围内流行,对奶牛的产奶量、公牛的繁殖力及役用牛的使役力均有较大的影响,给全球的养牛业造成了极大的影响。

我国规定,进出口牛及其肉制品必须检测IBRV,使该病的诊断方法迅速发展起来。生产中对该病的诊断首先应结合流行病学和临床检查做出初步诊断,然后根据实验室方法如血清学方法做出确切的诊断。

1 流行病学

牛是 IBRV自然感染的惟一宿主,试验证明IBRV可以通过很多途径感染牛,以肉牛易感,奶牛次之,而其他动物如绵羊、马、猪、犬、豚鼠和小鼠等不易感。带毒病畜是主要传染源。牛感染本病后,在自然条件下可不定期的排出病毒,这与本病的流行传播有重要的关系。

IBRV可通过空气、媒介物,以及与病牛直接接触而传播,但主要为飞沫、交配和接触传播。吸血昆虫也能传播本病。本病在秋季和冬季较易流行,特别是舍饲的大群奶牛在过分拥挤、密切接触的条件下更易迅速传播。尤以20日龄～60日龄犊牛在寒冷季节最易感染发病。另外,应激因素、社会因素、发情及分娩可能促使本病发作。

2 临床症状

IBRV致病性最大的特点是组织嗜性宽广,除经常侵害呼吸系统外,还能侵害生殖系统、神经系统和眼结膜。另外,自然感染时发病程度的差异很大,最轻的是无临床症状的隐性感染,只表现体温轻度升高,重症病牛则侵害整个鼻腔、咽喉和气管,导致急性上呼吸道炎症。临床上可以分成以下5种类型[2]。

2.1 呼吸道型

本病的呼吸道型是最重要的一种类型,人工感染的潜伏期为2 d～3 d,自然感染的潜伏期较长,可达1周。病毒首先侵入上呼吸道黏膜,其次是消化道,引起急性卡他性炎症,鼻分泌物由浆液性变为黏液性,最终变为脓性,并混有血液。临床表现为发热,病畜体温达42℃,食欲减退,呼吸困难并伴随鼻腔通道和气管有黏脓性分泌液流出,鼻孔开张,鼻甲骨和鼻镜充血并变红,又名“红鼻子病”。随病情的发展,常表现出不同程度的呼吸困难症状,但咳嗽并不经常出现。育肥牛体重减轻,奶牛的泌乳量减少。无继发感染时病程持续7 d～9 d,随后很快好转,恢复正常。

2.2 生殖道型

本病的生殖道型俗称交合疹、交媾疹。传染性脓疱性外阴-阴道炎的潜伏期较短,一般为24 h～72 h,随后是持续数天的轻度波浪式体温反应。外阴部发生轻度肿胀,黏膜发炎,表面散在多量白色小脓疱,严重的外阴表面的脓疱融合成淡黄色斑块和痂皮,结痂脱落后形成圆形裸露的表面。临床康复需10 d～14 d,阴道分泌物可持续数周,孕牛一般不发生流产,病程约2周。公牛感染,潜伏期2 d～3 d,在生殖道黏膜充血的同时表现一过性体温升高,数天后痊愈。较重病例呈现同母牛一样的体温升高和脓疱形成两种症状,后者主要见于包皮皱褶和阴茎头,数天后脓疱破溃,彻底痊愈需2周左右。

2.3 脑炎型

本病的脑炎型多发于犊牛,主要表现为脑膜炎,病牛共济失调,先沉郁后兴奋或沉郁兴奋交替发生,吐沫,惊厥,最后卧倒,角弓反张。发病率低,但病死率高。成田实报道,将分离于自然发病牛的中枢神经组织、鼻液和流产胎儿的IBRV株接种到犊牛的鼻腔、眼结膜和口腔后,可见发热和水样鼻液,但无神经症状。但接种任何病毒株的牛在病理组织学上均能见到神经胶质细胞增生和细胞管套状浸润形成的三叉神经炎及以延髓感觉神经通路为主要部位的非化脓性脑炎。据此认为,非化脓性感觉神经节炎和脑脊髓炎与黏膜炎症一样都是IBR主要的特征性病变。

2.4 结膜炎型

本病的结膜炎型多为角膜、结膜炎,常表现角膜下水肿,其上形成灰色坏死膜,呈颗粒状,眼、鼻流出浆性或脓性分泌物。有时可与呼吸道型同时发生。

2.5 流产型

本病的流产型见于初产青年母牛怀孕期的任何阶段,有时也见于经产牛。常见于怀孕5月～8月流产,多无前驱症状,胎衣不滞留。主要表现为突然发病,厌食,体温升高达39.5℃～42℃,结膜发炎,流鼻液,有的大量流涎,咳嗽,呼吸加速,病程约5 d。

3 病原学诊断

3.1 包涵体检查

因本病毒可在牛胚肾、睾丸、肺和皮肤的培养细胞中生长,并形成核内包涵体,故可用感染的单层细胞涂片,用 Lendrum染色法染色,镜检细胞核内包涵体,细胞核染成蓝色,包涵体染成红色,胶原为黄色。也可采取病牛病变部的上皮组织(上呼吸道、眼结膜、角膜等组织)制作切片后染色、镜检[1]。

3.2 病毒分离鉴定

根据临床症状不同,采集不同的样品:鼻气管炎以棉拭子采取处于发热期的鼻液和眼分泌物;外阴-阴道炎时采取外阴部黏膜和阴道分泌物,公牛则采集精液和包皮的生理盐水冲洗物;有流产胎儿时采取胎儿胸水、心包液、心血及肺等实质脏器;脑炎时采取脑组织。所有样品均应悬浮于运输培养基(含抗生素和20 mL/L犊牛血清的组织培养液)储存于4℃,并迅速送到实验室。样品送到实验室后,将拭子在运输培养基中充分搅动以便洗脱病毒,室温放置30 min再取出拭子,将运输液1 500 r/min离心10 min,取上清液作病毒分离的样品。进行病毒分离的精液需经特殊处理,因为精液中含有对细胞有毒或对病毒增殖有抑制作用的酶和其他因子[3]。

最常用于IBRV病毒分离的是牛胎肾或睾丸的单层细胞培养物,原代和次代均可。其次是猪胎肾细胞、牛肾继代细胞和牛气管继代细胞。当使用24孔培养板分离时,每孔需接种细胞培养物上清液100 μ L ～ 200 μ L,吸附 1 h 后倾去液 体,加 入维持液。每天观察细胞病变情况,一般于接种后3 d出现细胞病变(cytopathic effect,CPE)。细胞的典型变化是圆缩、聚集成葡萄样群落,在单层细胞上形成空洞,有时会发现有数个细胞核的巨大细胞。若7 d还不出现CPE,应再盲传1次,将培养物经反复冻融后离心,取其上清液用于接种新的单层细胞做进一步病毒分离。为鉴定致细胞病变的病毒是否为IBRV,细胞培养的上清液必须与特异IBRV抗血清或单克隆抗体(monoclonal antibody,MAb)进行中和试验[3]。

李琳琳等[4]利用MDBK细胞从进口种用奶牛鼻咽分泌物中分离出一株牛传染性鼻气管炎病毒,该病毒在MDBK细胞上产生明显的CPE,用抗IBRV特异性抗血清能中和分离株,并且用PCR扩增出特异性条带。王延涛[5]从黑龙江某养牛场发病牛阴道分泌物中分离出一株病毒,可被IBRV阳性血清所中和,用特异性引物能扩增出目的片段,通过理化特性分析和核酸序列分析证明是IBRV。

3.3 病毒核酸检测

病毒核酸的检测具有快速、特异、敏感、价廉等优点,解决了血清学诊断方法的许多缺陷,如各种方法诊断结果不一致、潜伏感染的动物检测抗原困难等,因此,近年来病毒核酸检测在临床诊断中得到了广泛的应用。

3.3.1 聚合酶链反应(PCR)检测技术 1993年Van der Engelenburg、Vilcek和Wiedman等建立了IBRV的聚合酶链反应(PCR)诊断方法,尽管不能完全替代单克隆抗体和免疫荧光法,但由于其灵敏度高和特异性强而应用于牛血清中微量IBRV的检测等方面。Rocha M A等建立了高度敏感的IBRV套式PCR检测方法,能够检测 10-3TCID50/50 μ L的细胞上清液。Frederick以 IBRV TK基因为模板,对4株野毒株扩增出183 kb的特异片段;Kibenge和Yason也是在 TK基因区分别设计了一对引物,建立了IBRV的PCR检测方法。Santurde G等[6]用Chelex100树脂吸附方法快速提取临床样品中的核酸增加了检测的灵敏度,这种PCR测定方法成本较低,可以作为血清库IBRV监测的有效工具。Takiuchi等[7]建立了一种IBRV套式PCR检测方法,从巴西某牛场死产胎儿中检测到IBRV,该方法可以有效而快速的对牛场的IBRV感染进行诊断。

在国内,张桂红等[8]建立了IBRV PCR诊断方法,该方法特异而敏感,可以应用于临床上病原的快速检测。

徐淑菲等[9]根据IBRV gB基因序列设计一对引物,进行PCR检测,并对反应条件及反应体系进行优化。结果得到与预期大小(362 bp)一致的特异性片段。用这对引物扩增IBRV、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV),只有IBRV扩增出特异性条带。该PCR方法的检测灵敏度为2.4 ng/100μ L,较其他方法敏感。

杨少华等[10]采用采用SDS-蛋白酶K法提取病毒核酸。根据IBRV gB基因序列设计了1对特异引物,在其上下游引物的内侧又分别设计了1对引物,以这4条引物对IBRV模板进行扩增。结果成功扩增出预期目的片段,建立了套式PCR检测方法。敏感性、特异性试验结果表明该方法能特异检测IBRV。本方法具有快速、灵敏、特异的优点,适用于在牛及其遗传物质的进出口检疫中进行IBRV快速检测。杨娟[11]根据已发表的IBRV gB基因序列,合成了2条引物,优化了反应条件,分别对IBRV的Bartha Nu/67株,IBRV-BK125株DNA模板进行扩增,结果对2株IBRV DNA均可扩增出362 bp的特异性片段;对猪伪狂犬病毒(PRV)、火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkeys,HVT)及牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)进行扩增均未见特异性条带。灵敏性检测表明,该法对IBRV的检出限量为711TCID50。将该PCR方法进行初步应用,与病毒分离所得结果基本一致。

3.3.2 核酸探针检测技术 近几年来,核酸探针已被广泛应用于病毒感染的检测,由于此法检测的阳性结果可以直接确定为IBRV的携带者,为流行病学调查和临床确诊提供了直接依据,要比传统的血清学方法更为敏感、特异。吴时友等从纯化的IBRV中提取全基因组DNA,用32P标记作为探针进行杂交,结果表明,该探针可检出10 pg的IBRV DNA,能明显区分IBRV感染细胞和未感染的正常细胞,具有相当高的灵敏度和特异性。随后用生物素代替32P制备的探针也取得了相同的结果,能检测牛精液中 IBRV DNA。由于此探针可在-20℃保存1年以上,有利于推广使用,又可弥补放射性同位素探针半衰期短及对人体健康有害的弊端。Pandita和Xia等报道了用斑点杂交法检测IBRV。

唐泰山等[12]根据IBRV的保守基因gB和gE序列,分别设计了2对引物及其相应的TaqMan探针,建立并优化反应体系后,利用10倍稀释的病毒进行扩增以检测其灵敏度,同时对伪狂犬病病毒(PRV)、马立克病病毒(MDV)、鸭瘟病毒(DPV)进行特异性检测。结果显示,建立的扩增gB和gE基因的荧光PCR可用于检测IBRV,其灵敏度为0.02 TCID50,而与PRV等其他病毒无交叉反应,具有快速、灵敏、准确、低污染等优点,可用于IBRV的检测。

4 血清学诊断

为控制IBRV的传播,消除该病的有效方法是对所有采集的血清进行监测。通常将血清中和试验(SN)、免疫荧光(FA)、琼脂扩散试验、间接血凝试验(IHA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等方法用于诊断IBRV急性感染和潜伏感染的动物。下面具体介绍一下常用的血清学方法。

4.1 中和试验

中和试验是本病最常用的血清学诊断方法。用IBRV种毒接种牛肾单层细胞,在细胞病变最明显时收获培养物,冻融2次,离心去除细胞碎片,收集上清。测定细胞半数感染量后等量分装,置-70℃保存备用。被检血清经56℃灭30 min。实验时将被检血清与等量的含100 TCID50病毒量的新鲜抗原混合,37℃孵育1 h后接种4管细胞培养物,室温吸附1 h,再加入 pH 7.2～7.4细胞维持液,置37℃培养,72 h后判定。当未稀释血清能抑制50%或50%以上细胞管出现CPE者判为阳性。实验时必须做病毒抗原、标准阳性血清及阴性血清的对照,病毒抗原对照和阴性血清加抗原对照应出现细胞病变;阳性血清加抗原对照应无细胞病变;被检血清对细胞应无毒性,对照细胞正常生长。

4.2 琼脂扩散试验

用已知的IBRV抗原检查被检血清中的沉淀抗体,也可用IBR阳性血清检测病料标本或细胞培养物的相应抗原。Suresh曾用免疫扩散法和对流免疫扩散法检测IBRV。

4.3 间接血凝试验

鞣酸处理法间接血凝试验(IHA)是简单易行的血清抗体检测法。可用常规的试管凝集法或微量凝集法进行。Dai曾用间接血凝试验检测 IBRV抗体,陈天祥等在1987年就报道,IHA是一种简单、快速、准确的血清学诊断方法。

4.4 酶联免疫吸附试验

曲新勇等用牦牛 IBRV85-Y株按 Cho等方法制备的抗原,经ELISA测定,表明其抗原性好,特异性强,操作简单、快速,使用于一般实验室,并比中和试验敏感。Florent应用 IBRV IgM 抗体捕获ELISA法进行IBRV的早期感染检测。以针对牛IgM的第一单抗作为捕获抗体,而第二单抗用来测定特异性抗病毒抗体。经试验感染和自然感染动物的血清检品检测,表明在临床症状出现后5 d～10 d的血清样品即可诊断出IBRV感染。Achilles于1990年建立了双抗夹心ELISA法,Kramps于1994年报道了ELISA是敏感、特异的检测方法。ELISA方法快速、准确、方便,已成为了目前检测IBRV的主要方法之一。

朱远茂等[13]成功的建立了检测牛血清IBRV抗体的间接ELISA方法,特异性和重复性试验结果表明,该方法特异性高、重复性好。与法国进口ELISA抗体诊断试剂盒比较,其符合率为96.3%,与中和试验比较,符合率为95.8%,且敏感性更高。

李兆利等[14]在国内首次利用重组gB蛋白建立了牛传染性鼻气管炎间接ELISA诊断方法,该方法具有操作简便、快速、无需进行组织培养、易于推广、检测样本量大等优点。通过交叉试验、比较试验等表明其灵敏度高、特异性好,从整体来看该方法优于传统的血清学方法,在IBR的普查检测、流行病学调查以及临床诊断中具有良好的应用前景。

王海燕[15]以纯化的IBRV Bartha Nu/67株建立了检测牛血清IBRV抗体的间接酶联免疫吸附试验。该诊断方法特异性高、重复性好,可用于流行病学调查。同时利用纯化的重组蛋白 pET32gEE建立了检测牛血清特异性gE抗体的间接酶联免疫吸附试验(gE-ELISA)。gE-ELISA诊断方法具有较高的特异性、重复性和敏感性,可用于区别gE缺失疫苗株及非缺失株诱导所产生的抗体。

杨娟[11]以 IBR山羊肾细胞病毒液作为包被抗原,建立了检测IBRV血清抗体的间接ELISA方法,并优化了反应条件和系统,利用该方法检测138份临床血清样品,与中和试验相比较,特异性为93.5%,敏感性为 93.5%,符合率为93.5%;与IDEXX试剂盒相比,符合率为 97.6%。利用该方法检测本实验室保存的230份牛血清,168份为阳性,与IDEXX试剂盒相比,符合率为87.8%;检测35份IBR感染的牦牛血清,21份为阳性,与中和试验相比,符合率为85.7%。

祖立闯等[16]用大肠埃希菌表达的IBRV重组gD蛋白纯化后作为包被抗原,建立了检测牛传染性鼻气管炎病毒抗体的间接ELISA方法。与中和试验相比较,符合率、敏感性和特异性分别为84.1%、85.0%、83.4%。该方法具有良好的敏感性和特异性,为国内IBR流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。

4.5 变态反应诊断

本法的检出率约为中和试验的2/3,但在缺乏实验室条件的地区是一种较为实用的诊断方法。应用一种灭活抗原(经膜超滤浓缩,再56℃加热 1 h和β-丙内酯处理的感染细胞培养液)进行接种。接种后20 min～30 min、6 h及72 h连续观察接种部位的皮肤,并检测红斑性肿胀的直径厚度,72 h作出最后判定,反应区直径在 1 cm以上者为阳性,0.5 cm～1 cm之间为可疑,0.5 cm以下判为阴性。

5 鉴别诊断

5.1 单克隆抗体技术

单克隆抗体技术的应用,使人类对IBRV的鉴别诊断提高到了一个新的水平,它的最大特点是通过单克隆抗体可以将疫苗免疫动物与自然感染动物有效地分开。一些发达国家规定,标记疫苗的使用必须有配套的鉴别诊断方法。因此根据疫苗株和缺失株所缺失的糖蛋白,各国学者已建立了抗gE、gC和gB的单抗,其中以 gE占主导地位。Van Oirschot制备了gE和gB两株单抗用来诊断 gE缺失株与野毒株感染[17]。Kit S等[18]用抗gC糖蛋白的单抗(McAb gC)鉴别诊断g缺失株、野毒感染株和TK基因缺失株。

王海燕[15]获得了3株分泌抗 IBRV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞;2株分泌抗gEE单克隆抗体的杂交瘤细胞和2株分泌抗 gEB单克隆抗体的杂交瘤细胞。这些单克隆抗体用双抗体夹心ELISA试验可区别IBRV阳性血清与阴性血清;同时gEE单抗和gEB单抗可初步区别 gE缺失株和gE非缺失株,为区别gE缺失标记疫苗株和自然感染株的鉴别诊断方法奠定了基础。

陈锃[19]利用纯化的病毒 IBRV Bartha Nu/67株作为免疫原,建立了一株稳定分泌抗IBRV gG蛋白McAb的杂交瘤细胞株E12,为建立能区分缺失病毒与野生病毒的分子鉴别诊断方法提供了材料。

王延涛[20]通过IBRV DQ01株全病毒蛋白免疫小鼠,细胞融合后筛选获得3株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。把杂交瘤细胞注入小鼠腹腔,生产了高效价的腹水(1∶16 000～1∶256 000),为IBRV的诊断提供了一定的基础材料。

5.2 PCR鉴别诊断技术

以IBRV的保守基因为模板,利用引物可对IBRV的潜伏感染进行确诊,此法特异性强、费时少,可用于活体检查,具有较大的使用价值。

陈茹等[21]采用LUX新型荧光PCR技术原理,以牛疱疹病毒I型(Bovine herpesvirus 1,BHV-1)的gC、gE基因为靶基因,建立了快速检测牛疱疹病毒I型以及鉴别野毒感染和基因缺失疫苗免疫动物的二重实时荧光PCR方法。采用该方法从临床牛血样、鼻拭子样品中检出BHV-1阳性样品,检测全程仅需约2 h。该方法可应用于临床快速诊断BHV-1病毒感染,鉴别BHV-1病毒感染与对应的基因缺失疫苗免疫动物。张桂红等[22]参照已发表的IBRV gB和TK基因序列,设计了两对引物,分别对已构建TK基因缺失(TK-)IBRV以及Bartha Nu/67株、美精株、洛精株、LA 株、B7株及云南株的IBRV进行扩增,均得到339 bp和457 bp的特异性片段,而T K-IBRV只出现110 bp的片段,扩增其它病毒未出现特异性条带,证明此法特异性强、建立的方法可以鉴别牛传染性鼻气管炎病毒野毒与TK基因缺失疫苗毒的感染。Fuchs M等[23]建立了一种敏感的PCR检测方法,可以鉴别诊断IBRV野毒和gE缺失疫苗毒的感染,有效的从自然感染IBRV的牛群外周血中检测到IBRV。

邓碧华等[24]根据野毒株和gE基因缺失疫苗株共有的IBRV gB基因序列设计了一套引物,又根据IBRV gE基因序列设计了另一套引物,建立了检测IBRV的套式PCR方法,该方法敏感性高、特异性强、操作方便,能够检测IBRV及有效区分IBRV野毒株和gE基因缺失疫苗株,可为IBRV诊断、监测和研究提供有效手段。

6 结语

随着我国规模化养殖业的发展,牛传染性鼻气管炎的威胁也与日俱增。随着科学技术的进步,对该病的诊断方法在不断的完善,快速、有效、敏感的诊断方法在临床上得到了广泛的应用。而对于兽医工作者来说,加强预防与控制,根除该病是最终目的。疫苗的研究在许多国家得到了开展[25],但由于IBRV的潜伏感染的特性,除了通过禁止接种、扑杀血清阳性牛还没有更好的方法来根除本病。因此,国内外的研究者应引起足够的重视。研究高效能的疫苗,消灭该病是今后兽医工作的一项艰巨任务,相信随着多基因缺失苗和病毒活载体重组苗的成功研制,根除IBR的计划将会在世界各地相继展开。

[1]殷 震,刘景华.动物病毒学[M].2版.北京:科学出版社,1997:1019-1029.

[2]Moretti B,Orfei Z,Mondino G,et al.Infectious bovine rhinotracheitis,clinical observations and isolation of virus[J].Vet Ital,1964,15:676.

[3]饶 辉.牛传染性鼻气管炎诊断技术研究进展[J].兽医导刊,2008,134(10):24-25

[4]李琳琳,谢怀根.从进口种用奶牛中分离传染性鼻气管炎病毒[J].中国草食动物,2008,28(4):57-78.

[5]王延涛.牛传染性鼻气管炎病毒分离鉴定及其抗克隆抗体制备[D].黑龙江大庆:黑龙江八一农垦大学,2008.

[6]Santurde G,Da Silva N,Villares R,et al.Rapid and hig h sensitivity test for direct detection of bovine herpesvirus-1 genome in clinical samples[J].Vet Microbiol,1996,49:81-92.

[7]Takiuchi E,Medici K C,Alfieri A F,et al.Bovine herpesvirus type 1 abortions detected by a semi-nested PCR in Brazilian cattle herds[J].Res Vet Sci,2005,79:85-88.

[8]张桂红,童光志,王 柳,等.牛传染性鼻气管炎病毒PCR诊断方法的研究[J].黑龙江畜牧兽医,2000(4):1-2.

[9]徐淑菲,孔繁德,周斌华.牛传染性鼻气管炎 PCR检测方法的建立[J].中国动物检疫,2006,23(11):26-28.

[10]杨少华,王长法,高运东,等.利用巢式PCR快速鉴定牛传染性鼻气管炎[J].家畜生态学报,2007,28(4):81-83.

[11]杨 娟.牛传染性鼻气管炎的快速诊断[D].北京:中国兽医药品监察所,2008.

[12]唐泰山,邓碧华,王凯英,等.牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立[J].动物医学进展,2009,30(4):14-16.

[13]朱远茂,王海燕,薛 飞.牛传染性鼻气管炎间接ELISA诊断方法的建立[J].中国兽医科技,2005,35(12):959-963.

[14]李兆利,薛 飞,朱远茂.牛传染性鼻气管炎病毒gB基因的截短表达与间接 ELISA诊断方法的建立[J].畜牧兽医学报,2006,37(12):1328-1333.

[15]王海燕.IBR间接ELISA的建立及重组gE糖蛋白与单抗的研制[D].吉林长春:吉林大学,2006.

[16]祖立闯,朱远茂,王延辉,等.牛传染性鼻气管炎病毒重组gD蛋白间接ELISA方法的建立及应用[J].中国预防兽医学报,2008,30(7):537-543.

[17]Van Oirschot J T,Kaashoek M J,M aris-Veldhuis M A.An enzyme-linked immunosorbent assay to detect antibodies against glycoprotein gE of bovine herpesvirus 1 allows differentiation between infected and vaccinated cattle[J].J Virol M ethods,1997(67):23-34.

[18]Kit S,Otsuka H,Kit M.Blocking ELISA for distinguishing infectious bovine rhinotracheitis virus(IBRV)-infected animals from those vaccinated with a gene-deleted marker vaccine[J].J Virol Methods,1992,40:45-56.

[19]陈 锃.牛传染性鼻气管炎病毒gG缺失株构建及gG单克隆抗体制备[D].湖北武汉:华中农业大学,2008.

[20]王延涛.牛传染性鼻气管炎病毒分离鉴定及其抗克隆抗体制备[D].黑龙江大庆:黑龙江八一农垦大学,2008.

[21]陈 茹,刘琳琳,曾彩云.牛疱疹病毒I型(BHV-1)二重 LUX荧光PCR鉴别检测方法的建立[J].中国兽医科学,2007,37(11):944-949.

[22]张桂红,童光志,王 柳,等.牛传染性鼻气管炎病毒TK基因缺失株与野毒株PCR鉴别诊断方法的研究[J].中国兽医科技,1999,29(5):3-5.

[23]Fuchs M,Hubert P,Detterer J,et al.Detection of Bovine herpesvirus type 1 in blood from naturally infected cattle by using a sensitive PCR that discriminates between wild-type virus and virus lacking glycoprotein E[J].Clin Microbiol,1999,37(8):2498-2507.

[24]邓碧华,王凯英,唐泰山,等.牛传染性鼻气管炎病毒套式PCR检测方法的建立[J].中国兽医学报,2008,28(6):649-651.

[25]Castruccci G,Figeri F,Salvatori D,et al.Vaccination of calves against bovine heresvirus-1:Assessment of the protective value of eight vaccines[J].Comp Immunol Infec Dis,2002,25:29-41.