影响猪繁殖与呼吸综合征病毒感染与增殖的因素*

韩明远,沈青春,张志刚,宁宜宝

(中国兽医药品监察所农业部兽用生物制品创制与评价重点开放实验室,北京 100081)

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine rep roductive and respiratory syndrom e,PRRS)是猪群中流行的重要的传染病之一,可引起母猪的繁殖障碍(包括流产、早产、死胎、木乃伊胎等)、仔猪成活率急剧下降和育成猪呼吸道症状等。病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),该病毒为单股正链RNA病毒,与马动脉炎病毒(Equine arteritis virus,EAV)、鼠乳酸脱氢酶升高症病毒(Lactate dehydrogenase elevating virus,LDV)及猴出血热病毒(Simian hemorrhagic fever virus,SHFV)同属于动脉炎病毒属[1]。

虽然PRRSV在感染猪脾脏、肝脏、派伊尔氏淋巴集结以及胸腺中均有发现,但是PRRSV具有严格的细胞嗜性,在体内主要感染猪肺巨噬细胞(porcine alveolarmacrophages,PAM)。其他细胞系如MA 104细胞、Marc-145细胞及CL2621细胞,多用于PRRSV体外增殖。与其他囊膜病毒感染细胞的过程相似,PRRSV需要首先与细胞受体结合,通过内吞作用进入细胞内,在胞内完成病毒的脱壳与基因组释放。PRRSV侵入细胞的机制与影响因素被研究人员所关注,自1998年段小波发现第1个PRRSV受体以来,多个PRRSV受体以及相关大分子物质被发现。到目前为止,包括细胞受体、胞内大分子物质和细胞因子在内的多个因素被证明能够影响PRRSV感染宿主细胞与在宿主细胞中增殖。

1 细胞受体

大多数病毒侵入宿主细胞首先要与细胞受体相互作用,使病毒富集于细胞表面,随后细胞受体介导病毒进入细胞质中或将相关信号传入细胞内部使病毒完成与细胞膜的融合[2]。为了解释PRRSV细胞嗜性的机制,人们一直在 PRRSV靶细胞中寻找PRRSV受体。K reutz LC[3]认为PRRSV细胞嗜性的决定性因素在于宿主细胞膜上的相关因子。目前在PAM与Marc-145中发现了多个PRRSV细胞受体,并且证明细胞受体在PRSSV进入细胞的过程中所起十分重要的作用。

1.1 PAM 中的PRRSV受体

唾液酸黏附素(sialoadhesin,Sn)在许多情况下能够帮助病原体感染宿主细胞。例如,能够表达Sn的CD14+单核细胞能够与人类免疫缺陷病毒(Hum an immunodeficiency virus,H IV)囊膜糖蛋白gp120上唾液酸残基发生相互作用,从而介导H IV感染细胞。与H IV将Sn作为细胞受体所不同,人鼻病毒(Human rhinoviruses,H RV)通过诱导树突状细胞(dend ritic cells,DC)表达Sn以抑制树突状细胞部分功能,从而在HRV感染机体后下调机体的适应性免疫应答水平[4-5]。

Sn也能够帮助PRRSV进入靶细胞中,并且试验证实Sn是PRRSV的受体。段小波最早使用能够阻断PRRSV感染PAM的单克隆抗体M b41D3与PAM作用,通过免疫沉淀的方法在PAM中找到了一个分子质量约为210 ku的细胞膜蛋白,并确定该蛋白为PRRSV受体。但该试验没有对该蛋白作进一步的分析,蛋白具体信息不明[6]。在随后的研究中通过对该210 ku蛋白进行胰蛋白酶消化,并对得到肽段用质谱方法得到蛋白序列,随后与蛋白数据库数据比对证明该210 ku蛋白为Sn[7]。虽然Sn能够介导PRRSV进入PAM,PRRSV也可以通过Sn非依赖性途径感染宿主细胞,但该途径只在特定细胞系中进行[8]。

在发现肝素可以抑制PRRSV感染M arc-145细胞之后,Delputte P L等[9]通过研究发现PAM表面存在的硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)能够与PRRSV相互作用,随后证实HS是PRRSV的受体,同时发现PRRSV中以M-GP5复合物形式存在的病毒基质蛋白是HS受体的主要结合位点。

确定Sn和HS为PRRSV受体后,Delputte P L等[10]通过试验发现肝素与m Ab41D3在共同作用下完全可以阻断PRRSV感染PAM。他认为只有这两种受体参与PRRSV感染PAM的过程。根据后续试验结果,Delputte P L认为 PRRSV感染PAM的早期首先与HS进行相互作用,使PRRSV在PAM的表面富集,进而促进PRRSV与Sn的相互作用,完成病毒的内化。

虽然在上述两种受体的作用下,PAM可以内化PRRSV,但是PRRSV基因组并没有在细胞质中释放,这说明还需要某种因子帮助PRRSV释放基因组,以使PRRSV在PAM中能够引起增殖性感染[9]。

1.2 Marc-145细胞中的PRRSV受体

虽然Jusa E R等通过试验发现肝素可以阻止PRRSV感染M arc-145细胞,但是 Kim JK等[11]认为PAM中的PRRSV受体Sn与HS并不能够在Marc-145细胞中表达。可见 PRRSV侵入 M arc-145细胞的途径与猪肺巨噬细胞所采取的途径截然不同。

Kim JK等[11]研究发现M arc-145细胞中的波形蛋白(vimentin)为PRRSV受体。波形蛋白为中间纤维的主要成分。中间纤维大致分为五类,分别为角蛋白纤维、波形纤维、结蛋白纤维、神经元纤维和神经胶质纤维。微丝(m icrofilam ent,MF)、微管(m icrotubule)与中间纤维(intermediate filament,IF)构成了细胞质骨架体系。除了构成细胞结构之外,波形蛋白在外源病毒侵入宿主细胞的过程中也起到了重要作用。Kim JK在试验中使用能够阻断PRRSV感染 M arc-145细胞的单克隆抗体 7G10(7G10MAb)与M arc-145细胞作用后,通过二维电泳和质谱分析的方法,发现与7G10MAb结合的蛋白复合物由7种蛋白构成,而通过Western b lot发现只有波形蛋白能够与7G10MAb直接结合。随后证实PRRSV可与波形蛋白发生结合,当将波形蛋白转入PRRSV非受纳细胞BHK之后,PRRSV可以感染该细胞,证明了波形蛋白为PRRSV的受体。同时该试验还证明M arc-145细胞的表面以及细胞质中均存在波形蛋白,且MARC-145波形蛋白的表达受PRRSV的调控。值得注意的是波形蛋白是重要的磷蛋白,能被多种蛋白激酶磷酸化,磷酸化作用可能会影响到波形蛋白的性质。例如磷酸化后的波形蛋白被高尔基体分泌到体外后会与病原发生作用,而波形蛋白的磷酸化可能与PRRSV严格的细胞嗜性有关。虽然波形蛋白被认为是PRRSV受体,但没有实验证明波形蛋白是否会引起病毒在细胞内的增殖性感染[11]。

除了受体作用外,完整的细胞骨架对于PRRSV在M arc-145细胞之间传播十分重要。当能够破坏完整细胞骨架的秋水仙素与细胞松弛素B共同作用于M arc-145细胞时,PRRSV的感染率下降。通过实验,Cafruny W A等[12]认为PRRSV感染Marc-145细胞分为两个过程,感染的初始阶段只发生在特定范围的细胞之中;在感染中后期,病毒由已感染细胞向未感染细胞进行传播。

1.3 Toll样受体

Toll样受体(toll like recep tor,TLR)在先天性免疫应答中所起到十分重要的作用,通过与其他模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)共同作用,对侵入机体病原微生物中存在的病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAM PS)进行识别,继而激活特定信号通路,使宿主细胞产生针对病原的防御作用。目前至少有10种TLR已经在人类和小鼠中发现[13]。

宿主细胞可以利用多种PRRs对PAMPs进行识别以诱导抗病毒应答,其中最主要的就是TLR。TLR3、TLR7、TLR 8和 TLR 9似乎构成了针对病毒病原相关分子模式的TLR亚群,其中TLR3识别病毒双股RNA(dsRNA),TLR7和TLR8识别来源于病毒基因组的dsRNA片段,TLR9则是识别在细菌与病毒中都常见的CpG基序。TLR通过MyD88依赖性信号通路或M yD88非依赖性信号通路,调控相关细胞因子的表达水平,从而完成对病毒的抑制作用[14]。

与Sn、Hs以及波形蛋白介导PRRSV感染靶细胞的作用不同,TLR3的表达能够抑制PRRSV感染PAM与M arc-145细胞。在近期的研究中,能够作为TLR3配体的 dsRNA Poly(I:C)被用于研究TLR3作用。这种人工合成dsRNA的使用能够上调TLR3表达,继而促进细胞IFN-r的合成,从而抑制PRRSV对细胞的感染[13]。

2 胞内大分子物质

虽然试验证明在PRRSV感染靶细胞的过程中PRRSV受体不可缺少,但是根据目前研究来看,PRRSV细胞受体只能帮助PRRSV通过内吞作用进入细胞质中,而病毒脱壳与病毒基因组的释放则需要在胞内大分子的协同作用下完成。

2.1 CD163

CD163分子是清道夫受体(scavenger receptor,SR)蛋白家族的一员。SR蛋白包括大量位于细胞表面的可溶性糖蛋白,这些糖蛋白可与配体识别,从而调节免疫应答水平。Calvert JG等[8]通过试验证实CD163分子在PRRSV感染M arc-145细胞的过程中起到了重要作用。将CD163在其他PRRSV非受纳细胞中的表达,能够促进PRRSV对这些细胞的感染,并产生病毒增殖能力。

PAM表面的CD163分子有助于PRRSV感染PAM。Van Gorp H等[15]通过研究发现当CD163特异性单克隆抗体与巨噬细胞在37℃下孵育后,PRRSV感染宿主细胞的效率下降了75%。而将抗CD163与抗Sn的抗体共同与PAM细胞进行孵育时可以完全阻断PRRSV感染。通过共聚焦显微镜分析,PRRSV与仅表达Sn的细胞作用时,只发生病毒颗粒的内化,但是不会发生病毒颗粒的脱壳。当PRRSV感染Sn与CD163共表达的细胞时,病毒颗粒的内化与病毒的脱壳同时发生,并且感染效率与单一表达CD 163的细胞相比要高10倍～100倍。通过上述实验Van Gorp H认为,CD163能够增加病毒感染宿主细胞的能力,但CD 163不是一个细胞受体,CD163只是介导PRRSV在细胞质中脱壳,并将病毒基因组释放。

综上所述,PRRSV在感染PAM的过程如下:PRRSV的基质蛋白(M蛋白)首先与PAM表面的HS发结合,使病毒颗在PAM表面富集。随后病毒颗粒上的唾液酸与PAM表面Sn受体相互作用共同完成病毒颗粒的内化。病毒内化后被转运到PAM细胞质中,细胞质中的pH低,而pH降低是病毒脱壳的必要条件。PRRSV在细胞内CD163分子的协同作用下完成脱壳,将病毒的基因组释放,使PRRSV在PAM中可以完成增殖性感染。

2.2 CD151

CD151也被认为在PRRSV感染靶细胞的过程中起到了重要作用。表达CD151的BHK细胞会出现PRRSV增殖性感染。同时对M arc-145细胞中的CD151的基因进行siRNA干扰,可抑制PRRSV感染M arc-145细胞的水平。CD151提升 PRRSV感染M arc-145细胞的能力主要是由于PRRSV 3′端非转录区(3′UTR)与CD151的发生结合导致[16]。

3 细胞因子的作用

3.1 干扰素对于PRRSV感染的影响

干扰素(interferon,IFN)在先天性免疫应答中所起十分重要的作用。干扰素分为Ⅰ型和Ⅱ型两种,其中Ⅰ型干扰素包括IFN-α、IFN-β,Ⅱ型干扰素为IFN-γ。通过调控数百种基因的转录水平,IFN诱导产生具有抗病毒作用的蛋白质,这些蛋白质包括蛋白质激酶(protein kinase,PKR)、2′,5′-寡腺苷酸合成酶(2′,5′-oligadeny late synthetase,OAS)和核糖核酸酶L(RNase L)、RNA特异性腺苷脱氨基酶(RNA-specific adenosine deaminase,ADAR)和M x蛋白。

PRRSV侵入机体之后,最初的免疫应答发生在被感染巨噬细胞中。在这些细胞中出现的dsRNA在胞内会引起一系列的级联反应,一般是以Ⅰ型干扰素的产生为标志。IFN-α能够抑制病毒在靶细胞内的复制,这主要是通过M x1蛋白起到抗病毒作用[17]。不同毒株对于IFN-α的敏感性不同,且诱导PAM产生IFN-α的能力也存在差异[18]。重组IFN-β可以抑制PRSSV感染PAM与Marc-145细胞[19]。值得注意的是PRRSV会抑制 IFN-a的分泌。PRRSV感染M arc-145细胞后,也不会产生Ⅰ型干扰素[20-21]。

虽然IFN-α具有抗病毒作用,但是Delputte P L等[22]认为使用IFN-α治疗会上调单核细胞中Sn表达,从而促进PRRSV感染单核细胞的能力。

PRRSV感染机体之后,血清中存在 IFN-γ,而在外周血单核细胞(PBMCs)、肺以及淋巴结中均发现了IFN-γ的mRNA[23]。虽然PRRSV在感染机体之后T细胞介导的IFN-γ应答水平逐渐升高,但是整体水平较为微弱[24]。IFN-γ既能够抑制PRRSV在PAM中的复制也可以阻断PRRSV在Marc-145细胞中的增殖。但是使用双股RNA诱导蛋白激酶的抑制剂 2-氨基嘌呤之后可以恢复PRRSV在M arc-145细胞中的增殖情况,说明IFNγ主要通过PKR途径抑制病毒增殖[12]。

3.2 IL-12

IL-12是促进细胞免疫、诱导T细胞以及NK细胞产生的IFN-γ重要物质。有报道称重组的IL-12能够介导PAM 产生IFN-γ,体外使用IL-12可以降低PAM中PRRSV的病毒滴度。IL-12已被用作PRRSV灭活疫苗与DNA疫苗的佐剂[25]。

4 小结

根据目前的相关报道,宿主细胞受体、胞内大分子物质以及细胞因子都会影响PRRSV感染宿主细胞与在宿主细胞增殖的过程。与多数病毒侵入细胞的过程相似,PRRSV在感染宿主细胞过程中需要细胞受体完成病毒颗粒在宿主细胞表面的富集与内化过程,这对于 PRRSV的进入宿主细胞十分重要。同时,胞内大分子物质在病毒脱壳以及病毒遗传物质释放过程中的发挥重要作用,目前的研究发现只有CD163和CD151分子涉及该过程。细胞因子对于PRRSV感染宿主细胞的抑制作用虽然不具有特异性,但是其作用不可忽视,部分研究中已经将细胞因子做为PRRSV疫苗佐剂使用以提升疫苗的效力。

目前用于研究影响病毒感染与增殖因素的技术较为成熟,但是仍存在一些问题制约相关研究。获取特异性的单克隆抗体对于细胞受体的发现十分重要,所有的PRRSV受体的发现都是通过单克隆抗体与细胞受体的特异性反应。同时,大分子物质的胞内定位技术也十分重要,虽然研究已经发现了两种大分子物质参与了PRRSV感染与增殖的过程,但是这两种大分子物质在胞内的具体位置需要通过定位技术确定,从而能够系统地了解病毒进入宿主细胞的整个过程。除了技术层面之外,基础研究整体水平的上升对于进一步研究影响PRRSV感染与增殖的因素十分关键。

研究影响PRRSV感染与增殖的因素,就预防与合理利用PRRSV而言十分关键。由于PRRSV感染机体初期,对PRRSV的抑制主要依赖于机体的抗病毒能力以及先天性免疫应答水平,在此时期通过抑制、阻断使PRRSV进入机体的因素或许会有效抑制病毒感染宿主。例如可以使用单克隆抗体封闭宿主细胞表面的PRRSV受体,使PRRSV无法与宿主细胞表面受体结合,从而病毒无法在宿主细胞表面完成富集与内化,以达到抑制PRRSV感染宿主细胞的目的。此外,PRRSV感染宿主具有持续性的特点,利用PRRSV感染的持续性将PRRSV改造成表达载体的研究较多,通过在表达系统中添加促进PRRSV感染的因素,可以改善PRRSV在宿主细胞的增殖状况,以提高目的蛋白的表达量。根据目前的研究,通过在表达系统中加入胞内大分子物质或者共表达该类大分子物质,可使PRRSV产生增殖性感染,实现提高蛋白表达产量的目的。

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