APE1/Ref－1线粒体定位机制的研究

朱剑武综述，李梦侠，王 东 审校

（第三军医大学大坪医院野战外科研究所肿瘤中心，重庆400042）

APE1/Ref－1是一种重要的多功能蛋白，主要功能是DNA修复和转录因子的氧化还原调控。目前认为，核编码基因的线粒体主动转运主要依靠线粒体外膜和内膜上一系列转运酶复合体，称为外膜转运酶（translocase of outer membrane，TOM）和内膜转运酶（translocase of inner membrane，TIM）。基本过程为线粒体外膜TOM复合体中的受体亚基，包括TOM20、TOM22和TOM70识别前体蛋白上的线粒体定位信号，而后通过TOM40等亚基形成的共同转运通道（general import pore，GIP）进入线粒体［1］。前体蛋白与不同的受体TOM蛋白结合，通过两类主要的转运机制进入线粒体［2］：（1）位于N端的线粒体定位序列（MTS）与TOM20、TOM22结合，是大多数线粒体定位基因的转运途径；（2）位于蛋白内部的信号肽与TOM70结合，主要是一类载体蛋白的转运途径［3］。本文从APE1/Ref－1的线粒体定位序列入手，阐明线粒体外膜TOM复合体识别 MTS的机制，并进一步探讨APE1/Ref－1的线粒体转位和干扰其线粒体定位的机制。

1 APE1/Ref－1在线粒体氧化应激反应中的作用

1.1APE1/Ref－1与氧化应激损伤 APE1/Ref－1是 DNA 碱基切除修复（BER）关键的限速酶，同时作为主要的AP核酸内切酶具有修复 AP位点和氧化还原双重功能［4］；另一方面APE1具有独特的氧化还原活性，通过控制DNA氧化还原状态的结合域调控某些转录因子的DNA亲和力［5］。DNA受活性氧（reactive oxygen species，ROS）攻击后形成 AP位点，从而导致DNA复制障碍或发生遗传变异。APE1/Ref－1作为核酸内切酶参与修复ROS引起的DNA损伤，在ROS诱导的疾病治疗中起关键作用。在认识到ROS在信号转导中起着核心作用之前，氧化应激被认为是促氧化剂和抗氧化剂之间的失衡，现在氧化应激被更多地认为是氧化还原信号转导和控制之间的紊乱［6］。ROS是生物体进行有氧呼吸时产生的副产品，外源性环境致癌物和电离辐射等因素也能诱导ROS的产生。ROS包括O2－、OH－、H2O2、ONOO－等，它们通常导致膜磷脂、膜蛋白、DNA碱基等的氧化性损伤和AP位点的形成，与心脏衰竭、脑局部缺血损伤、神经变形性疾病和衰老等病变过程密切相关［7］。生物体在受到外源性环境致癌物和电离辐射等刺激后，诱导产生大量ROS。ROS广泛攻击膜磷脂、膜蛋白、胞浆蛋白和 DNA，导致细胞的氧化性应激损伤［8］。APE/Ref－1能调控转录因子AP－1的氧化还原活性，还原被氧化的AP－1，恢复其DNA结合活性。有研究发现，ROS能够激活在CHO细胞中转染的APE1/Ref－1启动子，而且通过定点突变发现，使CREB结合位点失活能够使H2O2对于APE1/Ref－1启动子的激活失效。不仅如此，APE1/Ref－1的表达水平可以作为细胞氧化应激状态的标志分子，因此了解ROS诱导的细胞调控机制中信号通路的组成十分重要。

1.2APE1/Ref－1与线粒体氧化应激反应 APE1/Ref－1是一种在哺乳动物中高度保守的蛋白。在漫长的进化过程中，APE1和Ref－1这2个具有截然不同功能的亚基逐渐聚集到一起，形成一个密不可分的功能复合体，在细胞核内DNA损伤和氧化还原双功能都参与氧化应激后基因转录的调控，因此APE1/Ref－1可能不仅具有线粒体DNA修复活性，而且很可能具有氧化还原功能［9］。APE1在线粒体氧化应激反应中的重要作用得到广泛关注，以往研究表明，APE1蛋白水平在线粒体中表达量少，也就是说，常规的免疫技术很难定位检测它的表达水平［10］。目前研究发现，APE1可以在氧化应激等情况下转位至线粒体，而其理化性质决定APE1不能通过被动转运进入线粒体，说明该转位过程必定涉及主动转运途径。当线粒体受到不同的氧化应激物刺激时，如过氧化氢环境下，APE1在线粒体中的表达水平将明显增高，并与刺激物剂量相关且具有时间依赖性［11］。因此APE1的线粒体靶向定位应该是有先决条件的。有研究表明，抑制APE1的氧化还原功能将阻止鼠内皮细胞生长及血管发生，同时对人肿瘤细胞的血管发生及生长也有抑制作用［12］。APE1的生物学重要性在于APE1基因敲除的小鼠表现出胚胎致命性［13］。由于APE1的生物学活性都是与DNA损伤修复相关，目前研究发现，APE1蛋白主要定位于细胞核，但在氧化应激等刺激下可转位至线粒体基质，但其机制仍不明了，因此研究APE1/Ref－1分子与线粒体的氧化应激反应的调节机制显得十分重要。

2 APE1/Ref－1的线粒体转运机制

2.1线粒体蛋白的转运机制 mtDNA为环状双链DNA分子，虽然线粒体也能合成蛋白，但是合成能力有限。在线粒体1 000多种蛋白中，自身合成的仅10余种，编码37个基因产物，其中13种蛋白，包括1个细胞色素B基因，2个ATP酶复合体组成成分基因，3个细胞色素C氧化酶亚单位的基因及7个呼吸链NADH脱氢酶亚单位的基因；2个rRNA基因；还有22个tRNA基因［14］。绝大多数的线粒体蛋白是核基因所编码的并易位到线粒体。近年来蛋白跨膜运送研究有很大的进展，主要在于：（1）无论外、内膜都发现不少组成运送机器的膜蛋白［15］，其中个别蛋白已分离、纯化和重组于脂质体，并表现其功能［16］；（2）在跨膜运送前后有不止一种的“分子伴侣”参与，对运送过程起着重要的作用。分子伴侣在信号转导中也有重要作用。当细胞未受到激素刺激时，受体同分子伴侣结合在一起，核定位信号（nuclear localization signal，NLS）和 DNA 结合位都被隐蔽起来。当细胞受到信号分子的作用，脂溶性的激素进入细胞质，同相应受体上的激素结合位点结合，使受体同分子伴侣脱离，露出核定位信号和DNA结合位点。然后核定位蛋白通过核孔（nuclear pore）进入细胞核（nuclear）DNA结合位点，同染色体上的DNA结合，启动基因表达［17］。

2.2线粒体定位蛋白的运送途径 线粒体具有4个功能区隔，即外膜、内膜、膜间隙、基质，进入不同部位的蛋白具有不同的转运途径。进入外膜的蛋白具有不被切除的N端信号序列，其后还有疏水性序列作为停止转移序列，然后蛋白被TOM复合体安装到外膜上，如线粒体的各类孔蛋白。进入基质的蛋白可以先通过TOM复合体进入膜间隙，然后通过TIM复合体进入基质，也可以通过线粒体内、外膜间的接触点进入基质，在接触点上TOM与TIM协同作用完成蛋白向基质的输入，最后内膜的基质面上由ATP耦联的线粒体热休克蛋白70（mtHsp70）可以促进线粒体蛋白向基质转运的完成［18］。值得注意的是，在转运过程中线粒体蛋白都是以前体蛋白的形式存在，大多数是线性形式，经过转运复合体后进入线粒体的前体蛋白由线粒体的基质作用蛋白酶（matrix processing peptidase，MPP）切除前导序列，并在诸如热休克蛋白60（Hsp60）之类的分子伴侣的辅助下重新折叠成为活性蛋白。

线粒体蛋白的转运涉及多种蛋白复合体，由受体和蛋白通过的孔道两部分构成。主要包括：（1）TOM复合体，负责通过外膜，进入膜间隙，在酵母中TOM70负责转运内部具有信号序列的蛋白，TOM20负责转运N端具有信号序列的蛋白。TOM复合体的通道被称为GIP，主要由TOM40构成，还包括TOM22、TOM7、TOM6 和 TOM5。（2）TIM 复合体，其中TIM23负责将蛋白转运到基质，也可将某些蛋白安插在内膜；TIM22负责将线粒体的代谢物运输蛋白，如ADP/ATP和磷酸的转运蛋白插入内膜。（3）OXA复合体，负责将线粒体自身合成的蛋白插到内膜上，同样也可使经由TOM/TIM复合体进入基质的蛋白插入内膜。

2.3APE1/Ref－1的线粒体转运机制 据文献报道，不同长度的截短型APE1真核表达载体，并转染至HeLa细胞中以激光共聚焦显微镜观察其细胞内定位［19］。由于绿色荧光蛋白的激发发光需要其正确折叠形成的构象，因此在这一折叠过程中很可能影响了APE1残余序列的正确折叠，导致无法与线粒体外膜受体TOM蛋白相互识别而影响特异性的转位［20］。线粒体前体蛋白与不同的受体TOM蛋白结合，通过两类主要的转运机制进入线粒体［21］：（1）位于N端的线粒体定位序列（MTS）与TOM20、TOM22结合，是大多数线粒体定位基因的转运途径；（2）位于蛋白内部的信号肽与TOM70结合，主要是一类载体蛋白的转运途径［22］。核编码的线粒体定位前体蛋白均由线粒体表面受体识别，随后通过GIP将线粒体定位蛋白转位到外膜上（TOM）［23］。TOM 复合体主要由 TOM20、TOM22和TOM70等3个亚基构成，主要负责转运内部具有信号序列的蛋白，通过外膜，进入膜间隙。在体外纯化这3种受体蛋白的胞质便可确定特异的线粒体前体蛋白。线粒体输入蛋白研究表明，TOM20和TOM22是异二聚体受体，功能是转运携带裂解N－末端线粒体定位序列（MTS）的典型的线粒体前体蛋白。据文献报道，TOM70是负责将线粒体非裂解前体蛋白向内膜转运所必须的特异受体蛋白［24］。因此进一步研究APE1线粒体定位序列（MTS）与线粒体外膜上TOM蛋白受体结合的作用区域至关重要。

3 APE1/Ref－1的MTS线粒体定位机制

3.1APE1/Ref－1的MTS特征线粒体定位蛋白APE1/Ref－1与线粒体特异的靶蛋白不同，它被认为是一个双定位的线粒体蛋白，主要定位于胞核，可以在氧化应激等情况下转位至线粒体，且主要分布在线粒体细胞核内。然而APE1的线粒体定位机制尚不明确。APE1相对分子质量偏大，无法通过被动扩散的方式进入线粒体，此外由于其线粒体移位发生于线粒体膜电位改变之前，不可能通过线粒体外膜通透性增加来渗入线粒体，因此普遍认为APE1的线粒体转位是通过主动转运的方式进入的。目前的生物信息学研究发现，APE1蛋白并无典型的N端MTS，而其同源蛋白APE2却具有明确的MTS［25］，故早期研究认为，线粒体中的 APE活性主要是由APE2产生的，但是经后期研究发现，APE2与APE1同源性较低，且APE活性极弱，直至研究人员通过蛋白组学的方法在线粒体提取物中发现APE1蛋白才确证APE1是存在于线粒体中的主要AP核酸内切酶。对APE1/Ref－1N－末端序列仔细分析发现，并不存在典型的MTS，却具有典型的细胞核定位信号（NLS），有研究表明，APE1线粒体定位的前提条件即去掉N端的NLS，证明其线粒体定位信号肽可能存在于除N端之外的其余序列之中。Qu等［26］认为线粒体定位信号可能存在于靠近C端的某个区域内，但是并未具体说明其范围和序列特征。Dinur－Mills等［27］发现，双定位的线粒体蛋白有较弱的MTS，且蛋白整体净电荷较低。APE1/Ref－1蛋白含有一个非常规的定位信号，利用传统生物信息学的方法极有可能逃脱预测。

3.2APE1/Ref－1的MTS与TOM蛋白结合特性 线粒体外膜转运复合体TOM介导的转运严格依靠在胞浆核糖体中合成的前体蛋白中所携带的一段氨基酸序列，这种线粒体定位蛋白的前导序列被称为MTS，通过线粒体定位信号肽与线粒体外膜上受体的结合使前体蛋白定位于线粒体的表面，并穿过线粒体的双层膜结构，最终到达线粒体基质。以往利用一些计算机预测软件对线粒体亚细胞定位进行搜索预测，包括常用的预测软件MitoProt和TargetP均显示，APE1的MTS预测分数很低。有报道称，APE1主要被TOM20识别，表明APE1的线粒体易位可能通过TOM20依赖途径介导。TOM20识别一种位于N－末端裂解的线粒体前体蛋白信号序列MTS，此序列信号是具有两亲性螺旋的疏水氨基酸残基［28］。有学者认为，APE1的MTS是位于C－末端的尾锚定性前体蛋白。线粒体尾锚定性前体蛋白，包括Bcl－2和TOM20，它们经C－末端跨膜区插入到线粒体外膜［29］。虽然APE1在线粒体中尚无确切的定位特征性，但根据APE1的修复功能，它应该是伴随线粒体DNA分布在线粒体基质中。

通过多肽阵列扫描比较预测MTS与TOM蛋白亲和力的研究发现，结合有强大约束力的TOM蛋白的多肽遍布在整个蛋白中，很难确定APE1真实的MTS，结果只突出了一些可能的截短型APE1信号序列。TOM的3个受体蛋白对特定的线粒体靶蛋白表现出不同的亲和力。然而当与纯化的多肽相互作用时这些TOM受体蛋白表现出重叠的亲和力［30］。最值得注意的是，位于APE1的N－末端的位点K299、R301和K303只要发生丙氨酸置换突变便会减少肽与TOM20的亲和力［19］。更有趣的是，K24、K25、K27和 K31残基替换可增强TOM20亲和力。由于它们位于APE1的N－末端，这些特定的赖氨酸残基可能会抑制APE1的线粒体分布［19］。通过观察截短型APE1的亚细胞分布检测这些可能的定向序列，发现当N－末端的长序列包含在截短型APE1蛋白中，线粒体靶向作用非特异性。如果除掉大部分N－末端序列后，截短型APE1蛋白便具有线粒体特异的靶作用。虽然在C－末端它们均包含MTS，但似乎被隐藏在APE1蛋白的核心中，因此很难在线粒体表面接触到TOM蛋白，由此可以推断，APE1/Ref－1会靶向氧化应激后的线粒体，其中一个最可能的机制是细胞氧化还原失衡改变了APE1蛋白完整的N－末端构象，这种改变使氧化还原功能得以发挥并暴露出MTS与线粒体外膜上TOM蛋白接触区域。综上所述，通过分析亚线粒体组分研究APE1的线粒体定位，将有助于阐明其线粒体定位机制，为氧化应激后通过干扰APE1线粒体转位以促进细胞凋亡为目的提供新的靶向治疗策略。

4 小 结

APE/Ref－1是典型的双定位的复杂的生物大分子，在多种氧化应激刺激下它可以易位到线粒体发挥效应。随着生物芯片技术的发展，硅片法芯片技术为APE1的N－末端NLS的鉴定提供了新的契机。尽管目前的生物信息学方法尚无法确定APE1的MTS，但相信联合蛋白组学和实验室检测方法研究TOM蛋白和APE1/Ref－1的 MTS间的相互作用，可以为更好地理解APE1/Ref－1这个多功能生物大分子提供新的思路，有助于为进一步以APE1/Ref－1线粒体定位序列为靶点的基因治疗奠定良好的基础。

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