钙结合蛋白与皮质发育不良*

黄 敏 综述，晏 勇审校

(重庆医科大学附属第一医院神经内科 400016)

皮质发育不良(cortical dysplasia，CD)是各类脑发育畸形的总称，包括神经元异位(结节状异位、双皮质)、无脑回、巨脑回、多微脑回和脑穿通畸形、胼胝体发育不良或缺失等多种类型。其发病机制复杂，从胚胎期至成年期以前大脑发育过程中受到内外环境中有害因素的干扰或损害都可引起大脑皮质发育紊乱，临床以癫痫发作、发育迟缓、智力障碍等为主要表现[1-3]。在儿童难治性癫痫(intractable epilepsy，IE)患者手术脑组织的病理检查中发现CD约占40%，提示CD常见且和IE密切相关。近年的研究提示小清蛋白(parvalbumin，PV)、钙视网膜结合蛋白(calretinin，CR)、钙结合蛋白 D-28k(calbindin-D28k，CaBPD28k)可作为研究CD的层特异性标志物(layerspecific markers，LSMs)，并特异地表达于 GABA(r-aminobutyric acid，GABA)能中间神经元的亚群[4]。而癫痫的发生和GABA能神经元的损伤密切相关，因此，最近研究CD及其所致IE的病理生理机制中，有关 PV、C R、CaBPD28k的报道越来越多。本文就此方面的研究进展作一综述。

1 PV、CR和CaBPD28k的生物学特性

钙结合蛋白(calcium binding protein，CaBP)是一组具有E-F手形(E-F hand)保守结构的酸性蛋白超家族，能与钙离子高选择地结合，以多拷贝形式存在于细胞内，该家族包括Calbind-D28k、Calretinin、Calpain、Calci-neurin 等 200 多种蛋 白质，分激发型、缓冲剂型两大类。钙调蛋白是激发型蛋白的一种，能与钙离子结合后迅速扭转变形，进而结合靶分子以调节其活性;Calbindin-D属于缓冲剂型，可参与细胞内钙离子浓度的调节。其中，PV、CR和CaBPD28k是3种重要的钙结合蛋白，在中枢神经系统中表达丰富，并且在神经系统发育的不同阶段，其表达含量有所变化，具有多种重要的生理功能。

1.1 PV、CR和CaBPD28k的结构特点 PV是含有 6段α螺旋的小蛋白，其中CD和EF4段螺旋分别为2段环形的小肽连接，构成了螺旋-环-螺旋类型的超二级结构。2个钙离子结合在环区，而环区两侧的螺旋间的相对取向类似于人手伸展开时相互垂直的拇指和食指，这样的超二级结构被称为E-F手形。CR是一种在细胞内结合钙离子的蛋白，它的相对分子质量为31.5×103，属于具有E-F手形模序的肌钙蛋白 C超家族。CaBPD28k首先从禽类肠道中分离出来，是存在于真核细胞胞浆的维生素D依赖性的可溶性钙结合蛋白，维生素D及其代谢产物可对其活性进行调节，它的相对分子质量为28×103，由261个耐热酸性蛋白氨基酸残基组成多肽链，具有E-F手形，呈螺旋环状结构，由6个不同的螺旋状钙离子结合亚基组成单一球状蛋白[5]，是维持细胞正常生长发育所必需的蛋白质。

1.2 PV、CR和CaBPD28k在人类大脑皮质中的表达 在胚胎发育的第8～24周，侧脑室周围的神经祖细胞经有丝分裂形成的神经元经过侧脑室壁向外移行，形成软膜下前皮质板。随后产生的神经元迁移到前皮质板中将其分为表层的分子层和深部的皮质下板。后续产生的神经元陆续通过皮质下板和皮质板迁移到皮质第Ⅰ层下，先发育成熟的神经元移行至皮质深部，后发育成熟的神经元移行至皮质浅层，从而形成6层皮质结构。这种移行方式称为“内侧外翻”模式。

在人类胚胎发育的第21～25周，大脑皮质中开始出现CR免疫阳性细胞，主要位于皮质Ⅱ、Ⅲ层，CR免疫阳性细胞一般为双极、双束及卡扎尔(Caja1)星形细胞。PV免疫阳性细胞在胚胎中出现的时间较晚，一般为32～36周，主要位于皮质深层。在成人皮质，PV分布于除Ⅰ层外的所有皮质层，主要位于第Ⅳ层，其层特异性不如CR明显。PV免疫阳性细胞最具特征性的是大笼状或树枝状细胞。CaBPD28k免疫阳性细胞也出现在胚胎期的 32～36周，主要位于皮质Ⅱ、Ⅲ层，在成人主要位于第Ⅱ层，免疫阳性细胞一般为双束细胞。由此可见，PV、CR、CaBPD28k的表达具有较强的时空性，即在脑发育的不同时期和不同皮质区域，表达量有所不同，但成年后其表达部位和含量趋于稳定，提示其参与了某些阶段的神经系统发育且具有层特异性分布的特征。因此，研究其在神经系统中的作用和功能时，需要考虑年龄和结构等因素对其产生的影响。

1.3 PV、CR以及CaBPD28k在中枢神经系统中的作用PV、CR、CaBPD28k在中枢神经系统中含量丰富，具有多种重要的生理功能。其中，CaBPD28k的生理功能研究较多，PV和C R的研究相对较少，但研究表明，PV、CR以及CaBPD28k是3种重要的钙结合蛋白，在神经系统活动中至关重要。其主要功能:(1)与细胞内钙离子结合，作为钙离子的储存库，缓冲钙离子浓度的流向，调节钙依赖系统的功能，从而参与信息传递。(2)作为载体蛋白，参与细胞内钙的转导。(3)预防钙超载，通过对Ca2+缓冲、运输、激活细胞内与Ca2+相关的多种酶活性的作用，使细胞免受钙离子浓度过高而引起的毒性作用，使神经元对兴奋毒性有更持久的耐受性，具有重要的神经保护功能，有利于神经元持续点燃[6]。(4)PV、CR和 CaBPD28k分别表达于中枢神经系统中特定的GABA能抑制性中间神经元的亚群，互不重叠，这3种亚群构成了全部的GABA能神经元，而GABA能神经元可以合成和释放经典的抑制性神经递质γ-氨基丁酸，与癫痫等疾病的发生密切相关。(5)PV、CR和CaBPD28k的层特异性及细胞特异性分布特点可用来标记脑发育中一些皮质构筑特点和神经元回路，是 3种重要的LSM s[7]，通过检测其免疫阳性神经元的分布，有助于CD的诊断、分类和病理生理机制的研究。(6)它们能改变细胞膜上钙通道蛋白的活性，选择性提高细胞膜对钙离子的摄取。(7)CaBPD28k能作为钙敏感调节蛋白，通过与钙转运系统的其他分子如钙调素(CaM)、骨钙素(OC)等的协同作用，参与酶的激活，从而激活一系列其他的细胞内反应，如碱性磷酸酶;并可激活Mg2+、ATP酶等;通过结合并抑制细胞凋亡蛋白酶3(caspase-3，CPP3)的活性，防止大脑结构紊乱或形成有破坏性的斑块等(这些都是神经退行性疾病的标志);CaBPD28k还可进入细胞核，可能参与某些基因的活性调节。

2 PV、CR和CaBPD28k与CD的关系

与在啮齿类动物中的研究发现一样，许多LSM s在灵长类动物中属于同一分子家系，如钙结合蛋白[8-9]。CR、CaBPD28k能标记皮质Ⅱ、Ⅲ层的中间神经元，其层特异性比较明显。PV的层特异性不如前两者显著，但它联合囊泡膜谷氨酸转运体3(vesicular glutamate transporter3，VGLUT 3)、神经肽 Y(neturopetide，NPY)和生长抑素(somastatin)等标记物可用来标记多种不同类型的中间神经元，具有明显的细胞特异性分布。孕17 d母鼠腹腔注射甲基氧化偶氮甲醇(methylazoxymethanol，MAM)可导致子代鼠的CD，研究发现这些CD大鼠海马的PV阳性细胞减少[10];Ramona等[11]在用卡莫司汀建立的大鼠CD模型中，通过免疫组化染色发现其大脑皮质PV阳性细胞的空间分布和细胞形态均出现异常;Lurton等[12]研究 Taylor′s型局灶型CD患者大脑病灶的组织病理学和免疫组化时发现，PV免疫阳性着色出现在Ⅳ～Ⅴ层皮质的中间神经元和纤维中，PV免疫阴性的气球样细胞被阳性着色的纤维末端包绕形成篮状结构(basket)。Thom等[13]发现人类局灶型皮质发育不良和微小型皮质发育不良患者手术标本中，PV、CR和CaBPD28k免疫阳性的中间神经元减少，并出现了肥大或多极的钙结合蛋白免疫阳性的细胞。Zamecnik等[14]也发现在人类微小型皮质发育不良和Ⅰ、Ⅱ型局灶性皮质发育不良中，PV免疫阳性细胞分别减少了72.4%、55.0%、12.2%，在ⅡA和ⅡB型皮质发育不良中PV免疫阳性神经元的密度也不同，微小型皮质发育不良的颗粒下层中PV免疫阳性神经元数量显著降低。同样，Liu等[15]也发现在局灶型皮质发育不良患者病灶手术标本中，PV阳性神经元和纤维排列明显分散，PV阳性的中间神经元的数量减少，染色程度变浅，在Ⅱ型局灶性皮质发育不良中尤其明显。X染色体连锁的无脑回畸形伴外生殖器异常中，Okazaki等发现CR免疫阳性的细胞数量减少并出现神经元异位，异位神经元在白质和新皮质室下区也有出现。

这些研究主要通过组织病理学技术观察，先从形态学上大致确定皮质发育是否正常，再通过PV、C R和 CaBPD28k的免疫组化检测观察其阳性细胞的空间分布情况，与正常对照组比较，进一步证实CD的存在并进行分类。皮质发育障碍中，普遍存在PV、CR和CaBPD28k免疫阳性细胞数量的减少以及空间分布的紊乱。越来越多的研究提示，PV、CR和 CaBPD28k能标记特定神经元的亚群并标记皮质发育中大脑一些临时性构筑特点和神经元回路，可以作为鉴定CD的层特异性标志物。通过对其层特异性以及细胞特异性表达情况的观察，有助于为CD的诊断、分类以及CD中神经元的发生、增殖、分化以及迁移的研究提供更多的理论依据。并且，相对于其他的层特异性标志物，钙结合蛋白在对人类皮质发育的研究中具有特殊的用途，因为这些抗原对于抗自溶、甲醛固定、石蜡包埋等相对稳定，对脑组织的免疫组化分析更为合适[16]。

3 PV、CR和CaBPD28k与CD所致难治性癫痫的关系

Garbelli等[17]发现人类型CD所致的难治性癫痫患者的手术脑组织标本中PV免疫阳性中间神经元的密度显著降低，他们推测此型CD中PV低表达导致GABA能系统功能损害可能是癫痫发生的重要机制。André等[18]发现继发于Ⅰ型和Ⅱ型皮质发育不良的癫痫患者的手术脑标本中GABA能中间神经元数量、体积均出现改变，提示GABA能系统抑制功能降低可能在CD导致的癫痫中起了重要作用。Zamecnik等[19]也发现CD致癫痫患者的病灶中有斑片状的PV免疫阳性细胞缺失区。有研究表明在CD所致的难治性癫痫患者脑白质内，异位神经元体积增大且被PV免疫阳性的蓝状结构包绕。皮质发育障碍区和邻近的正常区域比较，兴奋性和抑制性突触的密度、比例都有改变，说明CD导致兴奋性和抑制性突触环路的改变可能与癫痫有关[20]，局部环路神经元的形态和分布异常在局灶性皮质发育障碍导致的局灶型癫痫放电的发布、延长以及持续运动信号的产生中可能有重要作用。Stacey等[21]研究端脑内部结构异位的大鼠(一种新皮质畸形的对癫痫敏感的遗传模型鼠)时发现在提痧皮质(tisha cortex)中异位和位置正常的神经元都出现了膜电位减低和输入阻抗增高，并出现了GABA能突触传递减弱，尤其是自发的抑制性突触后电流(inhibitory postsynaptic current，IPSCs)显著降低，IPSCs 的振幅也减小，而位置正常的神经元的抑制性神经支配的显著减弱与表达PV的GABA能中间神经元亚群的减少密切相关，说明抑制性GABA能中间神经元的神经传递被扰乱是癫痫发作的重要原因，进一步提示皮质发育不良使癫痫的发生阈值降低。Cai等[22]为了探讨局灶型皮质发育障碍所致癫痫的患者发作间期癫痫样放电(interictalepileptiform discharge，IED)与组织病理学改变之间的关系，通过长时程的视频脑电图检测将患者的IEDs分为4种类型，对手术切除的致痫区通过细胞免疫化学进行PV半定量评分，发现表现为棘波类型患者的PV得分高，为8分;多棘波亚型为5.6分，并且，局灶性皮质发育障碍的严重程度不同，病理表现不同，IEDs也不同。因此，他们推测PV得分高意味着成为致痫区的可能性低。

GABA能抑制性神经元是中枢神经系统中重要的中间神经元，能合成和释放经典的抑制性神经递质γ-氨基丁酸，在神经系统的抑制活动中起主要作用。钙结合蛋白中的PV、CaBPD28k具有神经保护功能。GABA能抑制性中间神经元数量减少、空间分布改变、形态异常等均可导致局部神经网络异常，都能使其对兴奋毒性的保护作用降低，使新皮质锥体神经元的抑制性功能受到损害[23]。

4 结 语

钙结合蛋白PV、CR和CaBPD28k特异地表达于GABA能抑制性中间神经元的亚群，且具有大脑皮质的层特异性特征，随着其测定方法的不断完善，结合皮质神经元的解剖、生理特征，有望成为临床上诊断CD的客观、准确的检测指标。与其他层特异性标志物一起作为CD神经病理学诊断的特异性免疫组化探针，揭示皮质发育的机制、皮质环路结构和功能，阐明CD的致痫机制。但是，目前研究还刚刚起步，很多问题尚未明确，如大脑在发育的不同时期、脑皮质不同部位其表达含量和分布存在的差异，研究者如何排除这些因素，在活体中如何准确检测其表达含量，阐明其致IE的具体机制等等。可喜的是，随着神经发育学的发展，研究者除了采用逆行标记、免疫组化、免疫荧光、激光共聚焦等一般研究方法之外，还可用采用单细胞RT-PCR研究、原位杂交以及微阵列分析、DNA数据库等分子生物学方法对其进行研究。相信在不久的将来，类似的层特异性标志物的研究将会为CD以及中枢神经系统其他疾病的研究开辟更加广阔的前景。

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