脑啡肽酶与阿尔茨海默病的研究进展

唐璟群综述,晏 勇审校

(重庆医科大学附属第一医院神经内科/重庆市神经病学重点实验室 400016)

阿尔茨海默病(Alzheimer′s Disease,AD)是老年人群中最常见的进行性神经变性疾病,主要临床表现为进行性认知及记忆功能丧失、精神行为异常等,是继冠心病、肿瘤和卒中之后的第4位主要死亡原因。AD主要病理学特征是细胞外老年斑沉积、细胞内神经原纤维缠结和神经元丢失等。其病因多样、发病机制复杂。目前广泛认同AD发生的核心机制是β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积。过去主要围绕Aβ生成增多和异常沉积的研究已硕果累累,揭示了多种蛋白酶类代谢异常和分子调控通路异常,而对Aβ降解减少导致过度沉积在AD发病中的作用研究较少。近年来部分研究揭示降解Aβ的酶主要有脑啡肽酶(Neprilysin,NEP)、胰岛素降解酶(IDE)、内皮素转换酶-1(ECE-1)和内皮素转换酶-2(ECE-2)等,其中NEP是脑实质内最主要的Aβ降解酶。现将近年来的研究进展综述如下。

1 NEP的生化特性

NEP(也称EC 3.4.24.11)位于细胞表面,属中性内肽酶M13家族中1个含锌离子的Ⅱ型膜蛋白,相对分子质量为97×103D,包括1个短的N-末端胞内结构域、1个跨膜螺旋和1个大的C-末端胞外催化结构域,其细胞外结构域有1个与催化作用有关的Zn2+结合序列(HExxH)的活性位点及参与二硫键构成的12个半胱氨酸残基[1-3]。NEP广泛分布于哺乳动物的肾脏、前列腺、睾丸、肺等组织中。用放射性自显影技术及酶活性检测发现,在脑内NEP主要分布于尾状核、苍白球、黑质、嗅球和脉络丛部位,在海马、大脑皮质、上下丘脑、杏仁核和中央灰质等部位次之。NEP由神经元内质网及高尔基体内合成并成熟,经轴突转运至分泌囊泡及突触前膜表面[4]。作为胞外酶,其水解作用发生在疏水氨基酸残基的氨基侧,优先水解细胞外小于5×103D的寡肽(5～40个氨基酸残基)。NEP对相对分子质量较小的 Aβ(含 40～42个疏水氨基)的降解具有重要作用。在体外实验中NEP能降解多种生物活性肽,如脑啡肽、生长抑素、胆囊收缩素、心房利钠肽、缓激肽、内皮素和P物质等,但在体内试验中仅有 NEP降解Aβ的证据[3]。

2 NEP与AD发病机制的研究

2.1 NEP与Aβ的分解代谢 Aβ由经轴突转运的淀粉样前体蛋白(APP)在突触前膜经过β-分泌酶(BACE1)及γ-分泌酶共同裂解产生。有两种构像,一种是难溶性的β折叠(Aβ ac),能迅速生成淀粉样沉积;另一种是可溶性的螺旋形结构(Aβnac),很难形成淀粉样纤维。Aβ纤维化后形成淀粉样沉积,产生神经毒性,或直接导致神经元功能障碍。Aβ在脑内被合成和降解,其稳态水平取决于合成和分解代谢间的平衡。研究揭示,随着年龄的增加NEP的活性下调、NEP基因缺陷或敲除该基因或于APP转基因鼠脑内注入NEP抑制剂等均引起Aβ降解减少而导致Aβ沉积和记忆损害,说明脑内NEP的主要特定功能之一是调节Aβ的分解代谢。Li等[5]持续3 d向小鼠脑室内注入NEP抑制剂——四氢噻吩,发现海马区内源性Aβ 40及Aβ42的不溶性片段沉积,且在 Morris水迷宫试验、物体识别试验和联想学习试验方面均表现出明显的学习及认知功能受损。Hemming等[6]将由慢病毒介导的转染NEP基因的原始成纤维细胞注入已形成淀粉样斑的APP转基因鼠脑内,发现细胞移植位点及海马区内的淀粉样斑数量明显减少。El-Amouri等[7]使用慢病毒载体作为基因转移系统在APP/ΔPS1转基因鼠皮质及海马区过度表达人NEP,4个月后检测结果显示,脑内淀粉样斑的数量减少了50%;左侧大脑半球Aβ40及 Aβ42的浓度分别降低了33%及40%,说明NEP的过度表达对增强Aβ降解、减少Aβ沉积及老年斑形成起了重要作用。Spencer等[8]向6个月龄的APP转基因鼠双侧大脑半球注入慢病毒载体介导的NEP(LV-NEP),6个月后经免疫印记分析发现,APP转基因鼠脑皮质及海马区NEP表达较对照组明显增高、活性增强。神经病理检查显示长达6个月的LV-NEP治疗可减少转基因鼠皮质区48%和海马区25%淀粉样物质沉积。

Guan等[9]通过慢病毒移植骨髓细胞的转导,在3xAg-AD鼠(129/C57Bl6/CD45.2)中成功地将NEP表达在白细胞表面,使Aβ降解为相对分子质量更小且无害的肽片段,促进Aβ从脑内向血浆运送及阻止外周血中的Aβ再进入脑内,最终使脑内Aβ水平降低了约30%,Aβ沉积物减少了50%～60%。Mohajeri和Wolfer[10]最近将敲除编译NEP的等位基因 Mme及过度表达人APP的双突变小鼠与APP基因改造鼠相比较,发现双突变鼠表现明显的淀粉样变性,且在Morris水迷宫学习记忆及条件性厌食试验中均有明显的认知功能损害。这表明即使NEP的部分缺乏(如同人类的老龄化过程),亦加剧了淀粉样变性的病理,并可能损害认知功能。

2.2 NEP的分布与Aβ的沉积 NEP在脑内的分布范围与Aβ的沉积区域呈反向关系,即Aβ的沉积区域内NEP分布最少。Iwata等[11]研究发现,NEP基因部分缺陷或活性部分下调均可引起内外源性Aβ的降解不足,导致Aβ过度沉积。在NEP基因缺乏的小鼠脑内,Aβ区域性分布在海马、大脑皮质、丘脑/纹状体、小脑,其中海马区含量最高,小脑最少,与 Aβ在AD患者脑内的分布一致。Fukami等[12]研究发现,NEP在海马区主要分布于CA1～3区的网状分子层及齿状回分子层,其次分布在透明层、齿状回多形细胞层、颗粒层以及海马锥体细胞层,而在CA1～3区的始层、辐射层及下脚最少。相反,Aβ则主要出现在NEP分布较少的CA1～3区的始层、辐射层及下脚。

Takeuchi等[13]用免疫组化分析研究不同年龄段的狗与猫脑内的NEP表达、活性及与Aβ的分布关系,发现在脑内NEP主要分布于尾状核、壳核、苍白球及黑质,其次为大脑皮质,而白质、小脑和海马几乎无NEP分布,各年龄段间无明显差别。在狗与猫脑内的NEP活性由高到低排列为丘脑/纹状体、大脑皮质、海马、白质。同时,他们研究 7岁和 9个月的狗及 10岁的猫脑内Aβ的沉积发现,年龄越大Aβ沉积的数量与频率越高,且以弥漫沉积或弥漫性老年斑这两种形式主要沉积在大脑海马区及皮质,而白质、尾状核、壳核、苍白球、黑质及小脑内无Aβ沉积。研究结果显示脑内 NEP与 Aβ的分布存在互补关系。

2.3 NEP减少Aβ所致的神经损伤 NEP的正常表达可有效地降解Aβ,减少 Aβ过度沉积所致的神经损伤。El-Amouri等[14]于2007年研究体外慢病毒载体介导的NEP过度表达保护神经元细胞免受Aβ毒性的效能。通过检测细胞的生存率,发现在表达人NEP的海马神经元HT22(HT22-hNEP)细胞中,经不同浓度的 Aβ1-40和 Aβ 1-42处理后,神经元细胞的生存能力均明显增强。由此推论,给AD患者脑内Aβ聚集的区域移植NEP基因就可减轻Aβ对神经元的毒性效应,可望成为AD治疗的靶点。

2.4 NEP改善 Aβ所致的空间记忆功能受损 NEP是 Aβ的主要降解酶,可减少老年斑的形成及相关神经病理改变和临床症状。Huang等[4]于 2006年将APP转基因鼠(APP23)与NEP缺乏鼠杂交(NEP-/-APP+),用Y型迷宫、物体识别试验、Morris水迷宫、条件恐惧学习等学习和记忆模型检测13～16周龄NEP-/-APP+鼠的空间工作记忆、视觉识别记忆、采集和保留相关记忆、联想记忆等,结果发现NEP-/-APP+鼠与海马区相关的认知功能均表现明显的损害。El-Amouri等[7]研究发现6～8个月龄的APP/ΔPS1转基因鼠存在大量的淀粉样斑沉积与空间记忆功能损害。而给脑内注入慢病毒载体介导的人NEP及绿色荧光蛋白的APP/ΔPS1转基因鼠在4个月后的Morris水迷宫试验的空间学习及记忆能力等方面较对照组明显增强。

3 影响NEP的因素

围绕AD特征性病理改变进行的多种研究发现高龄、基因突变、糖代谢异常、脂代谢异常、氧化应激、炎症反应、雌激素缺失、神经肽能神经递质功能缺损等多个环节参与AD的发病[15]。此外,亦有因素,如人参皂苷 Rg3、生长抑素、HIV-1 Tat等通过影响NEP的活性及表达,分别从不同的方向调控NEP表达,进而影响AD的发生发展,成为AD治疗策略的研究热点。

3.1 上调NEP的因素

3.1.1 人参皂苷Rg3 人参皂苷Rg3对脂多糖(LPS)诱导的多种细胞株中 NEP表达影响的多项研究表明,人参皂苷Rg3可减轻LPS对细胞内NEP表达的抑制,增加细胞内NEP的表达,对LPS造成的细胞毒性具有一定的保护作用,提示该物质有可能成为NEP的激活剂用于治疗AD。Yang等[16]于2009年研究在转染了瑞典突变的APP(SweAPP)的SK-N-SH细胞中人参皂苷Rg3对NEP的影响。免疫印迹发现人参皂苷Rg3以浓度依赖及时间依赖方式通过G-蛋白偶联受体介导的信号通路,明显增加NEP基因的表达,实时PCR分析发现,人参皂苷Rg3主要通过影响NEP转录水平增加其活性,进而明显降低Aβ 40及 Aβ42的水平,改善AD的神经损伤及认知损害。

3.1.2 生长抑素 生长抑素是一种神经肽,通过G-蛋白偶联受体信号通路起作用,其在脑内水平随着年龄增长而明显下降。Saito等[17]于2005年进行的体外实验显示,生长抑素可上调NEP的活性,且呈剂量依赖性增强,但是生长抑素缺乏不会引起NEP的mRNA和蛋白水平降低。根据体外实验推测生长抑素对NEP调节可能是通过翻译后过程,如增加NEP代谢和细胞定位等。Hama和Saido[18]于2005年为确定生长抑素在体内是否调节NEP的活性,测定了敲除生长抑素小鼠脑组织中的NEP,发现在海马及颞叶皮质区NEP活性明显下降,Aβ l-42的浓度增高了50%。体内外实验表明,生长抑素可以通过影响NEP的表达及突触前定位调节NEP活性,并引起脑内Aβ1-42浓度区域选择性降低。Aβ25-35是 Aβ1-40降解产生的毒性片段,生长抑素受体(SSTR)是生长抑素的神经调节信号,Burgos-Ramos等[19]于2008年研究发现向鼠脑室内注入Aβ25-35明显降低颞叶皮质生长抑素样免疫反应及生长抑素受体亚型-2(SSTR2)的mRNA和蛋白水平,其水平的降低能影响生长抑素上调NEP的活性,促进Aβ沉积。

3.2 下调NEP的因素

3.2.1 缺氧及氧化应激 除老年期随年龄增加NEP活性逐渐降低外,一些常见的脑部病理改变,如缺氧、中风、创伤等也与此有关。一些研究证明缺血、缺氧引起脑内NEP的分泌与活性降低。Nalivaeva等[20]研究短暂性脑缺血发作(TIA)和缺氧对NEP的影响,发现缺血、缺氧条件下 NEP的水平降低,再灌注后部分回复到原水平。产前轻度缺氧导致产后纹状体NEP表达水平下降,缺氧预处理通过血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(VEGFR-2)途径可起到神经保护作用。长期缺氧影响酶活性,进而引起基因表达及蛋白合成的变化,Fisk等[21]通过比较缺氧及氧化应激对人神经母细胞瘤NB7细胞NEP表达的影响,发现慢性缺氧导致NEP mRNA水平降低40%、蛋白水平降低 25%,而氧化应激分别为20%、30%。

3.2.2 HIV-1 Tat 因人类免疫缺陷病毒(HIV)相关性痴呆(HIV-associated dementia,HAD)具有与AD的Aβ沉积所致相同神经病理学改变,近年来备受关注。HAD脑内存在某些细胞因子如白介素-1、IFN-α、TNF-α等可以增加γ-分泌酶的活性,从而促进APP裂解为毒性Aβ片段。HIV-1基因能够编码一种被称为反式转录激活因子(transactivator of transcription,Tat)的蛋白,它是由2个外显子构成的非糖基化蛋白,在HIV复制过程中起重要的作用。Rempel和Pulliam[22]利用人脑神经细胞膜的聚合分数通过荧光检测分析Tat对NEP的抑制活性。Tat半胱氨酸丰富结构域通过共价键与NEP的活性位点相结合形成二聚体,起到抑制NEP降解Aβ的活性作用。体外研究发现,Tat蛋白可抑制80%NEP活性。将重组Tat直接注入脑培养基中,导致可溶性Aβ增加125%。研究人员又对14例HIV-1感染者和5例年龄相仿的对照者的尸检脑组织切片进行检测,结果发现前者脑中Aβ明显多于后者。进一步的分析显示,Aβ负荷与HIV-1感染病程明显相关,而与年龄无关,这就预示着当同龄健康人的脑中仅有少量或尚无Aβ积聚的时候,HIV感染者就可能已经存在极高负荷的Aβ,推测这与Tat抑制NEP的活性有关。为进一步研究Tat与NEP的关系,将Tat蛋白切割成 17个 Tat多肽(每个多肽含15个氨基酸残基),荧光分析法研究显示这些多肽中含KCCF氨基酸序列的多肽在抑制NEP方面起主导作用。Daily等[23]通过观察HIV感染(包括HIV-1血清学阳性)患者脑内 Aβ沉积变化探讨Tat抑制NEP的效应,发现源自Tat的半胱氨酸丰富区的多肽可明显抑制NEP,出现淀粉样物质沉积。这种抑制作用是竞争性和可逆性的,其抑制的机制目前尚不清楚。有学者认为是Tat的半胱氨酸丰富区与NEP Zn2+结合序列的活性位点通过非共价键相结合而抑制NEP的活性。

4 展 望

AD是一种以进行性高级认知功能障碍和记忆功能丧失为特征的疾病[24],其发病率随年龄增长而增加,65岁以上者约为5%。在AD的发病机制中,Aβ的降解及清除与Aβ形成和沉积具有同等重要作用。维持Aβ正常降解及清除能力的初步研究展示了希望,特别是通过病毒载体介导的NEP基因转染或细胞移植可上调NEP的活性,明显减少Aβ的沉积数量及速度,减轻Aβ所致的神经变性损伤,有望成为AD的治疗新靶点。但基因转染后NEP活性的有效持续时间、NEP过度表达后是否对机体带来不利影响等问题还需要在不同动物尤其在灵长类动物中进行深入研究。

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