地黄多糖的提取纯化工艺研究

赵平鸽，刘晓（1.浙江义乌市中心医院，义乌市3000；.徐州医学院药学院，徐州市1004）

地黄为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosaLibosch.的干燥根茎，为常用中药。药理实验已表明地黄对造血系统、内分泌系统、免疫、抗肿瘤及心血管系统等有着广泛的生物活性[1]。多糖作为提高机体免疫功能的保健品已被广泛开发，但许多多糖产品仅仅停留在保健品阶段，未能开发成药物，主要原因是多糖的分离纯化困难，技术不过关。目前对地黄多糖的提取及分离纯化的研究少见报道，特别是对地黄多糖的提取工艺的研究尚未见报道。为此，笔者对地黄多糖的提取与纯化工艺进行了研究，以期为地黄的开发及综合利用提供理论依据及参考。

1 材料

1.1 仪器

UV-probe型紫外分光光度计、Shimadu FTIR8300型红外光谱仪（日本岛津公司）；BSZ型自动部分收集器（上海沪西分析仪器厂）；电热恒温干燥箱（江苏金坛亿通电子有限公司）；层析柱（上海锦华实验仪器厂）；旋转蒸发仪（日本东京理化器械株氏会社）；PB203-N型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）。

1.2 试药

将采自河南怀庆的新鲜地黄（由浙江义乌市中心医院中药房鉴定为真品）浸入黄酒，酒液没过药面，用小火蒸干药液后取出晒干制得，将地黄在80℃烘箱中干燥至恒重，粉碎过20目筛，置干燥器中备用；乙醇、苯酚、石油醚、丙酮、正丁醇、浓硫酸、氯化钠、乙醚、氢氧化钠等均为分析纯；葡萄糖标准品（美国Sigma公司，纯度＞99%）。

2 方法与结果

2.1 地黄粗多糖的提取

取一定量的地黄，依次用石油醚、乙醚除去脂溶性杂质，然后用80%的乙醇脱单糖、低聚糖。加10倍量的水90～100℃提取3次，每次3 h，合并水提液，过滤。70℃水浴减压浓缩至适量，加入5倍量95%的乙醇纯析，静置过夜，离心过滤，真空冷冻干燥，得地黄多糖粗品。

2.2 地黄粗多糖的纯化

将地黄粗多糖溶于蒸馏水，去不溶物，按Sevag法（氯仿∶正丁醇＝4∶1）脱蛋白，重复10次以上，然后移至透析袋中用去离子水逆流透析24 h，直至紫外光谱分析检测无蛋白吸收。以氨水调节pH值为8，滴加H2O250℃保温脱色2 h，减压浓缩，加入5倍量的无水乙醇，静置过夜，离心收集沉淀，将沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚漂洗2次，冷冻干燥，得去蛋白地黄粗多糖纯品。

2.3 地黄多糖含量测定方法的建立

2.3.1 葡萄糖标准溶液的制备:精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品0.5g，蒸馏水溶解，加入0.25 mL浓硫酸，蒸馏水定容至50 mL，得浓度为1.0 mg·mL-1的葡萄糖标准溶液。

2.3.2 纯度的鉴定:称取适量熟地黄多糖，溶于蒸馏水后用紫外分光光度计在190～700 nm范围内进行全波长扫描，结果在260 nm和280 nm波长处无吸收峰，表明提取纯化的多糖中不含有核酸、蛋白质以及其它杂质成分。

2.3.3 检测波长的确定:精密称取干燥至恒重的葡萄糖标准品，用蒸馏水溶解后定容，配成浓度为116 μg·mL-1的标准溶液。根据苯酚-浓硫酸比色法[2]测定。多糖被浓硫酸水合时产生的高温迅速水解生成单糖，该单糖在强酸的条件下与苯酚反应生成橙色衍生物，此橙色衍生物在490 nm波长处有最大吸收峰，从而确定本研究的最大吸收峰为490 nm。

2.3.4 标准曲线的制备:精密移取葡萄糖标准溶液10、20、30、40、50、60、70、80 μL，分别置于具塞试管中，依次加蒸馏水使其总体积为2.0 mL，分别精密加入5%苯酚试剂1 mL摇匀，迅速精密滴加浓硫酸5 mL，以涡流混悬器快速混匀，放置5 min后置沸水浴中加热15 min，取出冷至室温。另以蒸馏水2.0 mL与上述操作同法加入苯酚溶液和浓硫酸，作为空白对照。将上述各溶液于490 nm波长处测定吸光度。以葡萄糖进样量（X）为横坐标，吸光度（Y）为纵坐标，进行直线回归，得回归方程为Y＝0.005 6X+0.436 1（r＝0.999 5）。结果表明，葡萄糖进样量在0.003 8～0.307 7 mg范围内与吸光度呈良好线性关系。

2.3.5 稳定性试验:取27.00 mg地黄粗多糖纯品，加蒸馏水溶解并定容至50 mL容量瓶中，摇匀，为样品贮备液。取样品贮备液0.5 mL，置于10 mL具塞试管中，加苯酚试液1.0 mL，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0 mL，摇匀。放置5 min，于沸水浴中加热15 min，取出，冷却至室温。分别在0、1、2、3、4、5 h时测定吸光度。结果，平均吸光度为0.327，RSD＝1.23%，表明样品溶液在4 h内稳定。

2.3.6 精密度试验:按“2.3.5”项下方法制备供试品溶液6份，每份1 mL，在490 nm波长处测定吸光度，计算多糖含量。结果，地黄多糖的平均含量为0.031 9 mg，RSD＝1.07%，表明该测定方法精密度良好。

2.3.7 重复性试验:精密称取同一样品粉末6份，按“2.3.5”项下方法制备供试品溶液，在490 nm波长处测定吸光度，计算多糖含量。结果，地黄多糖含量的RSD＝1.02%，表明本试验方法重复性良好。

2.3.8 加样回收率试验:精密称取已知含量的地黄粗多糖纯品6份，分别加入葡萄糖标准品适量，按“2.3.5”项下方法制备供试品溶液，在490 nm波长处测定吸光度，计算回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝5）Tab 1 The results of recovery test（n＝5）

2.3.9 样品含量测定:精密称取地黄粗多糖纯品0.5 g，按“2.3.5”项下方法制备供试品溶液，在490 nm波长处测定吸光度，计算地黄粗多糖含量，结果见表2。

表2 地黄多糖含量测定结果Tab 2 Results of content of R.glutinosa

3 讨论

多糖总糖含量测定是多糖提取分离的基础，一般依靠糖类物质的特征颜色反应进行。就反应的化学过程而言，可以分为两类，一类是以无机酸（硫酸或盐酸）使糖类脱水形成呋喃醛类衍生物，进一步与酚类或含氮碱缩合生成有色物质；另一类是以碱处理糖类，产生复杂的裂解衍生物，与某些试剂相作用，呈现特殊颜色。目前常用的多糖分析检测方法有苯酚-硫酸、蒽酮-硫酸和3，5-二硝基水杨酸法（简称DNS法）[3]。本试验中，笔者选用了苯酚-硫酸比色法对地黄粗多糖总糖含量进行测定。结果表明，改进后的苯酚-硫酸显色后在490 nm波长处有最大吸收。本研究中通过对苯酚-硫酸法的方法学考察，表明其方法简便易行、快速灵敏、精密度高、显色稳定、重复性好、准确度好，可以作为地黄多糖含量测定的有效方法。

乙醇作为多糖常用的一种沉降剂，其浓度与提取液的浓缩程度是影响沉降效果的关键因素。醇析时乙醇浓度过低，溶液中的多糖不能完全沉淀出来，而乙醇浓度过高会促使溶液中其它成分连同多糖一起析出，乙醇浓度在75%～85%范围内较好。未经浓缩的多糖提取液由于多糖含量较低，加入沉降剂后多糖浓度进一步下降，不利于多糖沉淀。本研究采用75%乙醇沉淀得到的地黄粗多糖，经光谱分析提取率高，其总糖平均含量亦较高。地黄多糖在空气中提取或干燥时颜色会加深，本研究中笔者在地黄多糖提取液除去色素的过程中用1%的活性炭，但在脱色时活性炭使用量大，样品损失较多，后改为H2O2，脱色效果较理想，因此笔者采用H2O2脱色工艺。笔者采用Sevage法脱除蛋白质的过程中，多糖损失较大，这可能是由于地黄中的多糖主要以糖肽和糖蛋白的形式存在。因此，为解决地黄脱除蛋白过程中多糖的损失尚需进一步研究。

[1]刘福君，赵修南，聂 伟，等.地黄低聚糖增强小鼠免疫功能的作用[J].中国药理学学报，1998，14（1）:90.

[2]边宝林，王宏洁，倪慕云.地黄及其炮制品中几种主要糖的含量测定[J].中国中药杂志，1992，20（8）:469.

[3]宋晓勇，刘 强，王子华.蒲公英多糖降糖药理作用研究[J].中国药房，2009，20（27）:2 095.