薄膜分散法制备紫杉醇微乳及其质量评价

周丽娟，刘清飞，陈曦，王义明，罗国安（1.郑州市中心医院药剂科，郑州市450007；.清华大学生命科学与医学研究院，北京市 100084）

紫杉醇（Paclitaxel，PTX）是一种萜类化合物，最早由Ghamande S等[1]从短叶紫杉的树皮中分离并确定其化学结构，是近年来疗效显著的抗癌药物之一。它能促进微管蛋白聚合、微管装配，防止解聚，使微管稳定，并能抑制细胞分裂增殖，临床可用于治疗卵巢癌、乳腺癌、子宫癌、肺癌、食管癌、前列腺癌等[2]。由于紫杉醇水溶性极差（约0.001 g·L-1），口服几乎不吸收，目前临床应用的注射剂是以聚氧乙烯氢化蓖麻油-无水乙醇（50∶50，V/V）制成的无色黏稠液体，临床使用时经氯化钠注射液或5%葡萄糖注射液稀释后静脉滴注。但制剂中聚氧乙烯氢化蓖麻油极易引起过敏反应和低血压，还可导致PVC包装中增塑剂的溶出，使毒性增加，稀释后宜析晶，从而限制了临床的应用[3，4]。

微乳可增加难溶性药物的溶解度，是难溶性药物的理想载体。研究中笔者改变了传统制备微乳的方法，采用制备胶束溶液或脂质体的薄膜分散法制备了紫杉醇O/W微乳（PTX ME），并对其处方、工艺及有关理化性质进行了研究。

1 材料

1.1 仪器

Agllent 1100型高效液相色谱仪，包括DAD检测器（美国安捷伦公司）；TEM-philips Tecnai 20型透射电镜（荷兰飞利浦公司）；Zetasizer Nano ZS90型激光粒度散射仪（英国马尔文公司）；BALZERS BAF-400D型冷冻蚀刻仪（列支敦士登公国Balzers公司）；XS105型电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；VDRTEX-5型旋涡混合器（江苏海门其林贝尔仪器公司）；RE-5285A型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SPX-250型微电脑恒温恒湿箱（上海特迅实业有限公司医疗设备厂）；SHH-100GD型强光照射试验箱（重庆永生试验仪器厂）。

1.2 试药

PTX原料（浙江海正药业股份有限公司，批号:20070601，纯度:98.63%）；PTX ME（笔者自制，批号:071201、071202、071203，规格:10 mL∶30 mg）；炔诺酮对照品（NTD ，批号:100053-200204）、PTX对照品（批号:100382-200301）均由中国药品生物制品检定所提供；聚氧乙烯醚（ELP）、泊洛沙姆188（德国Basf公司）；卵磷脂（S-100）、中碳链甘油酯（MCT）、橄榄油（德国Lipoid公司）；注射用大豆油（江西金海棠药用油公司）；维生素E（VE，广州白云山制药总厂）；脱氧胆酸钠（美国Sigma公司）；无水柠檬酸（AR级，维坊英轩实业有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；其余试剂均为分析纯，水为注射用水。

2 方法与结果

2.1 处方制备

2.1.1 溶剂的选择[5]分别取盛有约1 g的各种油（Oil）、表面活性剂（SA）、助表面活性剂（CoSA）的试管，分别逐渐加入PTX，涡旋12 h，置于60℃水浴中超声振荡8 h，室温平衡24 h，若PTX溶解，则在溶剂中再逐渐加入PTX，直至达到饱和，比较PTX在各种溶剂中的相对溶解度，选择制备PTX ME适宜的溶剂。可知，PTX 在 MCT（Oil）、ELP（SA）、无水乙醇（CoSA）中溶解度最大。PTX在不同溶剂中的相对溶解度见表1。

表1 PTX在不同溶剂中的相对溶解度（37℃）Tab 1 Relative solubility of paclitaxel in different solvents（37℃）

2.1.2 PTX ME的处方优选 按表1的定性测定结果，选择MCT作为油相，ELP作为SA；处方中为了减少ELP的用量，同时加入S-100作为SA，无水乙醇为CoSA；为了防止处方中的S-100氧化，加入VE作为抗氧剂；加入DOC-Na有助于提高PTX的溶解度，也可作为辅助SA。各处方中将VE的量固定为0.5%，S-100的量固定为5%（处方规格:10 mL∶30 mg）。参考文献[5，6]中绘制的伪三元相图，选取在微乳区域的几个处方，制备PTX ME，以制剂的外观性状、稀释后放置的稳定性、粒径作为评价指标，选出最优处方。PTX ME处方优化见表2（配伍后稳定性指加5%葡萄糖溶液稀释10倍后溶液的稳定性）。

表2 PTX ME处方优化Tab 2 Prescription optimization of PTX ME

2.1.3 PTX ME的制备 称取处方量的PTX、ELP、S-100、DOC-Na、MCT、VE，置于圆底烧瓶中，再加入处方量的无水乙醇，70℃水浴加热使全部溶解，40℃水浴下旋转蒸干，再于40℃真空干燥箱中干燥24 h，加入处方总量3%的无水乙醇和少量注射用水，磁力搅拌使其全溶，在磁力搅拌下缓缓滴加注射用水至全量的80%时，用适量的无水柠檬酸调节溶液pH值至5.0，加入注射用活性炭，吸附30 min，过滤脱炭，补加注射用水至全量，无菌条件下灌封于安瓿中，即得。结果表明，处方2、3配伍后稳定时间长，均能满足临床用药要求，但处方3中ELP的用量相对较大，过敏反应强，故选择2号为最优处方。

2.2 PTX ME的质量控制

2.2.1 外观性状 制备的PTX ME为澄明淡黄色液体。

2.2.2 pH值 按2005年版《中国药典》（二部）附录pH值测定法，测定其pH值为4.83。

2.2.3 形态学[7]研究 采用冷冻蚀刻技术[5]对PTX ME进行冷冻处理，于透射电镜下观察并照相，微乳乳滴呈圆球形，分布均匀。PTX ME冷冻蚀刻电镜照片见图1。

2.2.4 粒径及分布考察[8，9]取PTX ME适量，加5%的葡萄糖注射液或0.9%的氯化钠注射液分别稀释10倍，用激光粒度散射仪测定微乳的粒径及其分布。结果表明，PTX ME的平均粒径分别为20.8 nm和20.7 nm，多分散指数为0.084和0.077，呈Gauss分布，约90%的粒子分布在11～32 nm。PTX ME经5%葡萄糖注射液稀释后的粒径分布见图2。

2.2.5 载药量和包封率的测定 （1）色谱条件:色谱柱为Agilent Tc-C18（250 mm×4.6 mm，5µm），流动相为甲醇-乙腈-水（35∶35∶30），流速为1.0 mL·min-1，检测波长为227 nm，柱温为30 ℃，进样量为10 µL。方法学[10、11]表明，PTX空白微乳不干扰测定；PTX与NTD的分离度为4.98。线性方程为f＝0.058 3C＋0.011 7（r＝0.999 9，n＝6）。测定日内8 h和日间3 d的精密度，RSD分别为0.45%（n＝6）和0.64%（n＝6）；平均回收率为99.80%，RSD＝0.77%（n＝9）。可见，方法的精密度、回收率均较好。PTX的HPLC图见图3。

（2）包封率测定[12]:参照2005年版《中国药典》微囊、微球与脂质体指导原则的要求进行本品的包封率测定。①洗脱曲线的考察:将葡聚糖凝胶G50用蒸馏水充分溶胀后装柱（柱高∶内径＝6∶1），洗脱液为蒸馏水。精密量取微乳（取PTX ME注射液，加5%葡萄糖注射液稀释10倍）0.5 mL上柱，每1 mL收集1份样品，然后按“2.2.5（1）”项下色谱条件测定。结果，微乳于6～13 mL之间流出，游离药物于16 mL开始流出，微乳与游离药物能完全分开。②柱层析方法的回收率考察:取微乳0.5 mL上柱后，13 mL前用蒸馏水洗脱，流出13 mL以后用20%乙醇溶液洗脱，收集25 mL内的洗脱液，加甲醇定容至25 mL。然后按“2.2.5（1）”项下色谱条件测定洗脱后的药物总量（W），并测定原上样0.5 mL微乳中含有的药物总量（W0），按下式计算:柱回收率（%）＝W/W0×100%。分别按上法上样0.4、0.5、0.6 mL，结果，柱回收率分别为99.31%、98.89%、97.11%（n＝3），表明该方法具有较高的回收率。③包封率的测定:按“2.2.5（2）①”项下方法，收集微乳部分的洗脱液，加甲醇定容至25 mL，按“2.2.5（1）”项下色谱条件，测定收集的流出液中的药物总量W；取同批样品测定0.5 mL微乳中含有的药物总量W0；包封率（%）＝W/W0×100%。载药量和包封率的测定结果见表3。

表3 载药量和包封率的测定结果（±s，n＝3）Tab 3 Drug-loading rate and encapsulated efficiency of PTX ME（±s，n＝3）

表3 载药量和包封率的测定结果（±s，n＝3）Tab 3 Drug-loading rate and encapsulated efficiency of PTX ME（±s，n＝3）

批号71201 71202 71203包封率/%97.03±2.54 97.89±1.68 96.24±2.74载药量/g·L-1 3.032±0.004 2.985±0.003 3.015±0.004

2.2.6 稳定性试验 （1）配伍试验:PTX ME在临床使用时，须用5%葡萄糖注射液或0.9%氯化钠注射液稀释后静脉滴注，因此笔者进行配伍试验观察其稳定性。结果，配伍后12 h内一直呈略带乳光的澄清透明溶液，含量、pH值、平均粒径均无明显变化，表明该制剂在12 h内稳定。（2）影响因素考察:①光照试验:取PTX ME注射液（批号:071201），置于60℃恒温箱中，4 ℃、光照（4 000～5 000 Lx）放置10 d，分别于0、5、10 d末取样测定。②冻融试验:将样品置于－4℃2 d，再放置于40℃2 d，即冻融1次，连续循环3次，考察外观、pH值、载药量、粒径、有关物质[13]。微乳除了在60℃和40℃试验条件下有关物质略有增加外，其他条件各项指标均无明显变化，表明PTX ME受温度影响较大，高温贮藏不稳定，应低温放置。PTX ME的稳定性试验结果见表4。

表4 PTX ME的稳定性试验结果（n＝3）Tab 4 Stability of PTX ME（n＝3）

3 讨论

研究中选取的辅料均可供注射用；且选取的最优处方中ELP的用量只有3%，相对于市售的PTX注射液（用量为50%）减少了94%，极大降低了过敏反应的发生率。

处方中加入的S-100有利于PTX和形成微乳乳滴的稳定性。DOC-Na的加入增加了膜的稳定性和PTX的溶解性，阻止了PTX的析出，而且毒副作用小，广泛用于乳剂型注射剂制备的使用中[14]。笔者将常用的制备脂质体和胶束的薄膜分散法和微乳制备方法相结合应用于制备微乳，突破了微乳传统的制备方法，扩展了新技术的应用范围，这将为其它药物微乳的制备提供参考。

色谱条件优选中，经预试验发现，采用甲醇-乙腈-水（20∶30∶50）[13]的流动相，PTX的出峰时间太慢，保留时间约30 min。通过调节流动相的比例，最终确定流动相为甲醇-乙腈-水（35∶35∶30），PTX和NTD的出峰时间可控制在10 min内，且能达到很好的分离，能节省分析时间，提高分析效率。

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