桑叶总黄酮的提取纯化工艺研究

马金秋，李丹，马向前，张晓宇#（1.河北秦皇岛市第一医院，秦皇岛市066000；.吉林省人民医院检验科，长春市 1001；.燕山大学，秦皇岛市 066004）

桑叶为桑科植物桑Morus albaL.的叶，临床上广泛用于利尿、降血糖、降血脂、降血压等。桑叶富含异槲皮苷、槲皮苷、胆碱、有机酸、维生素、氨基酸[1]等保健活性成分和营养成分，其中芸香苷、槲皮素、异槲皮素、二氢山茶等黄酮类化合物占干叶重的1.0%～3.0%，是植物茎叶中黄酮类化合物含量较高的一种。黄酮类化合物是天然的抗氧化剂，具有清除人体中超氧离子自由基的生理活性，且具有抗癌、抗衰老和抗氧化等多种药理作用，因此对桑叶中黄酮类成分提取纯化工艺的探讨具有重要意义。

1 材料

1.1 仪器

RE-52A型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；UV2265型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；W2010型数控恒温浴锅（上海申胜生物技术有限公司）；SK3300H型超声仪（上海科导超声仪有限公司）。

1.2 试药

桑叶购自秦皇岛市安平大药房，经秦皇岛市人民医院田凤英主管中药师鉴定为真品；芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，批号:100080-200306）；硫代巴比妥酸（TBA）、二苯代苦味肼基（DPPH，美国Sigma公司）；AB-8型大孔吸附树脂（南开大学化工厂）；其余试剂为国产分析纯。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 标准曲线的制备:参考文献[2]进行。取干燥至恒重的芦丁对照品约10 mg，精密称定，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，得1.05 mg·mL-1的芦丁对照品贮备液。精密吸取芦丁对照品贮备液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加入新配制的5%NaNO2溶液0.5 mL，放置5 min后，加入10%Al（NO3）30.5 mL，放置5 min，再加入4%NaOH溶液4 mL，蒸馏水定容，摇匀，放置15 min，510 nm波长处测定吸光度。以芦丁对照品浓度（X）为横坐标，吸光度（Y）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为Y＝12.78X－0.017（r＝0.998 8）。结果表明，芦丁对照品在0.010 5～0.063 mg·mL-1浓度范围内与吸光度线性关系良好。

2.1.2 供试品溶液的制备:取烘干、粉碎过40目筛的桑叶样品约1 g，精密称定，置索氏提取器中，乙醚脱脂后挥干乙醚，将脱脂过的桑叶置于锥形瓶中，按表1和表2加乙醇浸泡30 min，超声波提取器中提取一定时间，过滤，滤液挥干乙醇，用甲醇溶解，过滤，定容于50 mL容量瓶中，制得9个供试品溶液。

2.1.3 样品含量测定:精密吸取供试品溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，按照“2.1.1”项下“加5%NaNO2溶液0.5 mL”起至“510 nm波长处测定吸光度”操作，根据回归方程计算样品中总黄酮含量。

2.1.4 精密度试验:精密吸取同一供试品溶液，按“2.1.1”项下方法测定吸光度，连续测定6次。结果，RSD＝1.19%，表明方法精密度良好。

2.1.5 重复性试验:取同一批桑叶样品6份，各1 g，精密称定，按“2.1.1”项下方法测定吸光度，计算供试品溶液中总黄酮含量。结果，RSD＝2.38%，表明本方法具有较好的重复性。

2.1.6 稳定性试验:对同一份供试品溶液，每隔1 h按“2.1.1”项下方法测定1次含量，共测6次。结果，RSD＝1.95%，表明桑叶黄酮提取液在6 h内基本稳定。

2.1.7 加样回收率试验:精密称取已知含量的样品6份，加入一定浓度的芦丁对照品溶液，按“2.1.1”项下方法测定吸光度。结果，平均回收率为98.63%，RSD＝2.02%，表明本方法回收率高。

2.2 工艺研究

2.2.1 提取溶剂的确定:根据文献资料[3]确定黄酮提取的常用方法主要有热水提取法、碱性水溶液提取法、乙醇提取法、甲醇提取法、丙酮提取法等。以1/20（W/V）的比例用沸水、80℃下的碱性水溶液（pH 9.0）、60%乙醇溶液、60%甲醇溶液和60%丙酮溶液，按照“2.1.1”项下方法测定总黄酮含量。结果表明，甲醇和乙醇提取效果较为接近且优于其他方法，鉴于甲醇毒性较高，考虑到用于食品的安全性，本试验黄酮提取溶剂选用一定浓度乙醇。

2.2.2 正交试验设计:为系统考察乙醇超声提取桑叶总黄酮的工艺参数，根据预试验的结果选择乙醇浓度（A）、提取温度（B）、料液比（C）、超声波辅助提取时间（D）作为考察因素，以样品中总黄酮含量为考察指标，进行L9（34）正交试验。因素水平见表1；正交试验结果见表2；方差分析结果见表3。

表1 因素水平Tab 1 Levels and factors

表2 正交试验结果Tab 2 Results of orthogonal experiment

表3 方差分析结果Tab 3 Results of variance analysis

通过综合评价，各因素对总黄酮提取率影响的顺序为B＞A＞C＞D。最佳的提取工艺为A3B3C3D2，即在80℃用20倍于原料的80%乙醇超声提取40 min。从表2可知，选用60%和80%乙醇浓度的提取率均值分别为2.411%、2.412%，并无显著影响。因此在实际生产中，考虑到成本等经济条件，选用60%的乙醇。

2.2.3 验证试验:称取桑叶药材，按最佳的提取工艺平行提取3次，结果总黄酮平均含量为2.52%，提取物纯度达到48.7%，表明该提取工艺科学、合理、可行性强。

2.3 黄酮化合物的纯化

对所得桑叶总黄酮粗品用AB-8型大孔吸附树脂进行纯化，具体按文献[4]方法进行，略有改进。得最佳工艺条件为:以20 mg·mL-1浓度上样，6倍量水洗涤，70%乙醇洗脱。此条件下，乙醇洗脱物中桑叶总黄酮纯度达到63.2%。

3 讨论

桑叶药食兼佳，资源丰富，是一种极有潜力的天然抗氧化剂资源，有望于研制成为高效、低毒、价廉的抗衰老保健食品或药品。

通过对正交试验及方差分析结果综合评价，最佳的提取工艺为A3B3C3D2，即在80℃用20倍于原料的80%乙醇超声提取40 min。温度和有机溶剂浓度在所考察范围内对试验结果影响较为明显，而料液比和超声提取时间在考察范围内影响很小。笔者采用超声波辅助提取桑叶总黄酮的工艺方法与传统工艺方法比较具有节时、节能、操作简单、提取率高等特点。但是试验中可以观察到，超声提取时间加长，桑叶中含有脂溶性杂质溶出也随之增加，因此建议超声时间为40 min。

从表2结果可以看出，乙醇浓度增大，得率增大。从理论上来说，游离黄酮难溶于水或不溶于水，易溶于乙醇溶剂，但黄酮类化合物在植物中可与糖结合形成糖苷如芦丁，与生物碱结合形成黄酮生物碱，因为黄酮苷和黄酮生物碱溶于水、乙醇中，用水可提取水溶性黄酮类化合物如黄酮苷，用乙醇即可提取水溶性黄酮化合物，故乙醇浓度对提取率具有明显影响。从表2可以看出，选用60%和80%乙醇浓度提取率均值分别为2.411、2.412，影响不显著，因此在实际生产中，考虑到成本等经济条件，选用60%的乙醇。表3的结果表明，对于D因素，F值接近1，说明因素水平间无显著差异；B、A因素F值越大，其因素水平改变对指标的影响较大，但由于试验次数较少，未见显著差异。结果表明，A、B、C、D几种因素对黄酮提取率的影响程度差异较大。

考虑到应用正交试验的优化组合提取桑叶黄酮，提取物纯度为48.7%，为进一步提高其纯度，根据桑叶黄酮具有多酚结构和糖苷链，产生氢键能力较强，采用大孔树脂通过表面吸附、表面电性或形成氢键而起到较好的吸附作用。本试验中笔者选用了极性较好、比表面积大、交联效果及孔隙度都较好的AB-8型大孔吸附树脂对黄酮类化合物进行纯化，选择性地吸附黄酮类化合物，使黄酮纯度提高至63.2%，从而达到纯化的目的。与一般方法相比，应用大孔树脂纯化桑叶总黄酮，能得到较高纯度的总黄酮，方法简便、迅速、经济，结果稳定、可靠。

[1]孙 莲，张 煊，孟 磊，等.柱前衍生RP-HPLC法测定桑叶中16种游离氨基酸的含量[J].中国药房，2008，19（36）:2 830.

[2]孙敏耀，唐文照，卢 霞，等.分光光度法测定不同采收时间桑叶中总黄酮[J].中草药，2004，35（10）:1 190.

[3]张 睿，徐雅琴，时 阳.黄酮类化合物提取工艺研究[J].食品与机械，2003，22（1）:21.

[4]王 芳，励建荣，蒋跃明.桑叶黄酮的提取纯化及对油脂抗氧化活性的研究[J].中国粮油学报，2006，21（4）:106.