顶空固相微萃取法测定哈密瓜中挥发性芳香成分研究

贾 恺，胡小松，廖小军，张名位，陈 芳，吴继红,*

(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，农业部果蔬加工重点开放实验室，教育部果蔬加工工程研究中心，北京100083；2.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，广东 广州 5 10610)

顶空固相微萃取法测定哈密瓜中挥发性芳香成分研究

贾 恺1，胡小松1，廖小军1，张名位2，陈 芳1，吴继红1,*

(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，农业部果蔬加工重点开放实验室，教育部果蔬加工工程研究中心，北京100083；2.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，广东 广州 5 10610)

采用顶空固相微萃取(HS-SPME)方法研究哈密瓜汁中挥发性芳香成分(VFC)，对电解质(盐)、萃取温度、萃取时间进行单因素和正交试验。结果表明：应用PDMS/DVB/CAR(聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯/碳分子筛) 50/30μm萃取头，8mL哈密瓜汁中加入2.4g饱和电解质NaCl，在40℃萃取40min，哈密瓜GC谱图峰面积最大，VFC萃取和检测效果最好；该方法加标回收率为86.8%～97.6%，线性范围8.24～217ng/mL，最小检测限7.21ng/mL，方法灵敏度和重现性好。哈密瓜中主要的VFC为乙酸乙酯、乙酸丙酯、2-甲基丙酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯和壬醛等。

顶空固相微萃取；正交试验；挥发性芳香物质；哈密瓜

哈密瓜(Cucumis melon. var. recticulatus. Hamimelon)诱人的香气成分是其产品品质重要的评价指标[1-6]。哈密瓜属热敏性瓜果，在加热处理数分钟后其香气成分便损失殆尽，且产生令人不愉快的蒸煮味，完全失去了其

原有的风味品质特征，因此哈密瓜热加工中的变味问题引起了风味研究者的关注，成为该领域研究热点和难点。

采用不同提香方法会产生不同的分析结果。1971年Kemp等[7]在用减压蒸馏法提取的风味浓缩物中检出了大量的九碳醇类和醛类，只发现极微量的酯类和苯甲醛。1997年宛晓春等[8]采用Amberlite XAD-2吸附新疆伽师瓜香气，得到13种成分，主要是醇、醛、酮，酯类仅有2种，认为3,6-壬二烯醇、6-壬烯醇、苯甲醇及呋喃类物质是哈密瓜风味的主体成分。2004年马永昆等[9]采用固相微萃取方法对不同成熟度金皇后甜瓜汁的香气进行富集，得到45种成熟金皇后甜瓜的挥发成分，初步确定9种成分为金皇后甜瓜的特征香气。

SPME方法应用于哈密瓜香气成分的研究相对较少，缺少SPME方法实验参数的系统研究。在马永昆研究工作基础上，结合HS-SPME-GC-MS技术对伽师瓜果汁香气成分的实验参数加以探讨、优化并对其可行性加以分析，确定出最佳萃取条件，并对哈密瓜果汁挥发性芳香物质进行了系统分析和鉴定，以期建立快速、稳定、高效的检测手段和技术，为今后建立不同品种哈密瓜香气的色谱图库、科学评价鉴定哈密瓜的香气品质以及哈密瓜变味机理的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

伽师瓜[哈密瓜(Hami Melon)的一种]采自新疆吐鲁番地区，选取大小和果色一致的果实，取果肉榨汁，200目滤网过滤，－1 8℃冻藏。

庚醇、辛醛、壬醛、柠檬烯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸己酯、己酸丁酯(标准品，色谱纯)上海爱普香料有限公司；乙酸乙酯(色谱纯，纯度大于99.5%)；以上标准品均用甲醇(色谱纯)分别配成一定浓度的储备液备用；氯化钠(分析纯)。

1.2 仪器与设备

手动SPME进样器 美国Supelco公司；HP5973气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent 公司；SP-3400气相色谱 北京分析仪器厂；榨汁机 上海灿坤电器公司。

1.3 方法

1.3.1 SPME操作

SPME 顶空萃取：选取大小和果色一致的果实3个(约9kg)，去皮榨汁并过滤待用。取果汁8mL放入15mL样品萃取瓶中，加入2.4g氯化钠，使其质量浓度为0.3g/mL，内标及磁力转子置于固相微萃取工作台上预热10min；将固相微萃取器的聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯/碳分子筛(Polydimethylsiloxane/Divinylbenzene/ Carboxen，PDMS/DVB/CAR)萃取头通过瓶盖聚四氟乙烯隔垫插入样品萃取瓶的顶空，推出吸附头使其暴露于萃取瓶顶空蒸汽中进行萃取。当样品萃取平衡后，缩回纤维头，迅速将针管插入气相色谱仪的进样口，推出纤维头热解析3min，同时启动气相色谱仪采集数据。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：HP-5毛细管柱(25m×0.2mm，0.11μm)；升温程序：40℃保持2min，以4℃/min 升至75℃，以1℃/min 升至80℃，以10℃/min升温至230℃，保持3min；载气(N2)流速1.0mL/min。进样器温度250℃；检测器温度250℃，无分流进样。以色谱峰保留时间定性，以内标法定量计算。

1.3.3 质谱条件

电子轰击(EI)离子源；电子能量70eV；传输线温度250℃；质量扫描范围m/z 15～500。

1.3.4 定性定量

定性：利用GC-MS进行定性，通过计算机检索与NIST02质谱库提供的标准质谱图对照，并参照文献[7]、[9]进行确认。

定量：数据处理采用BF2002 色谱工作站软件。选择庚醇为内标，使其在哈密瓜果汁中的质量浓度为20.4ng/mL，以哈密瓜果汁中代表性的香气物质测定它们对庚醇的响应因子。哈密瓜果汁中鉴定出的醇类、酯类和醛类物质的质量浓度以相应的真实物质或结构相近的物质的相对响应因子计算。

根据方法的设计原理，SPME加热温度、萃取时间、盐添加量被认为是影响目标化合物在萃取膜上的萃取效率[10]的主要因素。本实验对上述条件进行三因素三水平的正交试验，以峰面积为判定指标进行直观分析；在此优化条件基础上，进行方法线性范围、回收率、检出限等实验。每个处理进行3次平行实验，测定结果取其平均值。

2 结果与分析

2.1 哈密瓜果汁萃取条件研究

2.1.1 SPME萃取效果单因素试验

2.1.1.1 盐效应对萃取效率的影响

本实验对添加电解质——饱和NaCl溶液(2.4g N aCl，即0.3g/mL)、半饱和NaCl溶液(1.2g NaCl，即0.15g/mL)和不加NaCl溶液的哈密瓜果汁进行了对比。

由图1可以看出，除丁酸乙酯外，加入饱和电解质NaCl溶液的样品各组分的萃取量明显高于半饱和NaCl溶液和不加NaCl溶液的样品，所以实验过程中采用NaCl用量为2.4g。当往液态基体中加入NaCl等盐类物质时可以增大溶液的离子强度，降低基体对挥发性物质的束

缚，提高其中有机物的逸出活度，促进其从液态基体中挥发出来，吸附到纤维头上，从而降低了该方法的检测限，提高香气成分的响应值。从图中还可以看出，除了丁酸乙酯外，随着NaCl用量增大，大部分香气成分萃取效果明显提高，说明不同的挥发性物质其挥发性对NaCl的用量存在着差异。

图1 不同用量NaCl的萃取效应Fig.1 Effect of NaCl amount on the extraction of 5 volatile compounds using a PDMS/DVB/CAR fiber

2.1.1.2 萃取温度的确定

固定采样时间和气相色谱条件的情况下，萃取温度对吸附效果的影响如图2所示。实验比较了20、30、40、50、60℃不同温度条件下对萃取效果的影响，由图2可知，升高温度可以增强香气成分的萃取效果，但当温度超过50℃时，乙酸乙酯萃取量呈下降的趋势，而壬醛、庚醇、柠檬烯还未达到吸附平衡。这是因为不同的香气成分具有不同的物化性质，所以吸附的难易程度不同，达到吸附平衡的时间也不同。操君喜等[11]对哈密瓜进行70℃热处理后，经鉴定全为C8～C40的烷烃类化合物，表明其风味物质全部丧失。考虑到升高温度可能会引起哈密瓜果汁中香气物质发生化学变化，所以适宜的萃取温度为30～40℃。

图2 萃取温度对萃取量的影响Fig.2 Effect of temperature on the extraction of 5 volatile compounds using a PDMS/DVB/CAR fiber

2.1.1.3 萃取时间的确定

实验发现，当萃取温度保持不变时，随着萃取时间的延长，哈密瓜果汁中各组分的含量不断上升，如图3所示。但是当萃取时间超过40min后，壬醛、乙酸乙酯的萃取效果呈下降趋势，这是因为随着时间的延长，吸附在纤维头上易挥发的物质得到解析。同时，由于时间的延长，果实中自由水和结合水的蒸发析出，使纤维头凝结水滴，从而大大降低了纤维头对挥发性芳香物质的吸附。所以最佳吸附时间为30～40min。

图3 萃取时间对萃取效果的影响Fig.3 Effects of extraction time on the extraction of 5 volatile compounds using a PDMS/DVB/CAR fiber

2.1.2 哈密瓜果汁最佳萃取参数的确定

采用L9(33)正交试验，确定SPME萃取哈密瓜果汁芳香成分的最佳参数。选择SPME萃取温度(A)、萃取时间(B)、电解质NaCl的用量(C)3个因素，其因素水平设计见表1。

表1 L9(33)正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

表2 正交试验结果Table 2 Arrangement and experimental results of the orthogonal array design

由表2 可知，各因素影响主次顺序为C＞B＞A，

较优水平组合为A2B3C3。最终确定最佳试验条件为加入2.4g饱和电解质NaCl(即0.3g/mL)，40℃萃取40min。

2.1.3 SPME萃取方法精密度和准确度的测定

2.1.3.1 标样回收率的测定

定量分析采用内标法，根据萃取后样品中待测组分与内标之间的关系：Coi=FisACosAi/As，(Coi待测组分含量；FisA峰面积定量相对响应因子；Cos内标物含量；Ai待测物质峰面积；As内标物峰面积)若内标物的含量恒定，则FisACos/As恒定，待测组分含量与其峰面积成正比。选取2-甲基丁酸乙酯、辛醛、乙酸己酯、己酸丁酯制成标准物质混合液加入到果汁中，用SPME方法测得其加标回收率为86.8%～97.6%，如表3 所示，说明方法准确结果可靠。

2.1.3.2 线性范围和最小检出限的测定

分别取5个质量浓度梯度的标准物质混合液，其中均含有20.4ng/mL庚醇内标物。分别加入到脱香果浆中[12]，采用SPME与GC分析计算出各组分在8.24～217ng/mL测量质量浓度范围内，峰面积与质量浓度呈线性关系，最小检测量为7.21ng/mL。各标样标准曲线回归方程均呈现一次线性，回归方程中系数a、b及回归系数R2如表3所示。

表3 标样回收率及回归方程系数Table 3 Recoveries for ethyl 2-methylbutyrate, octanal, hexyl acetate and n-butyl acetate

2.2 哈密瓜VFC的GC-MS测定

图4 哈密瓜果汁挥发性芳香物质SPME-GC-MS总离子色谱图Fig.4 Total ion chromatogram of volatile components of Jiashi muskmelon obtained by optimized HS-SPME

应用上述得到的HS-SPME-GC-MS最佳操作条件，对哈密瓜果汁GC-MS 分析的总离子色谱图如图4所示。可以看出，各种香气成分的峰尖且窄，相邻峰均完全得到分离，说明实验用气相色谱和质谱条件能满足哈密瓜香气成分分离的要求。

表4 哈密瓜果汁挥发性芳香物质SPME-GC-MS分析成分一览表Table 4 Volatile composition in Jiashi muskmelon analyzed by the developed SPME/GC-MS method

采用固相微萃取技术分析哈密瓜果汁中的香气成分，只需少量的原料即可得到满意的结果。哈密瓜香气成分的色谱图上共鉴定出了42 个挥发性芳香化合物，见表4。按峰面积计算，其含量占哈密瓜果汁挥发性成分的93%。它们由酯类、醇类、醛类和烯烃构成，其中酯类有2 8种，醇类有5种，醛类有5种，烯烃类有3种，酸类1种。伽师瓜果汁香气成分的峰面积占79.95%的是酯类，醇类占7.64%，醛类占2.94%和烯烃占2.50%。与文献[9]报道的哈密瓜芳香成分鉴定结果相比，主要挥发性芳香物质组成基本一致。这些成分呈现出的似蜜香、花香、果香、醇香和清鲜香气混合组成了伽师瓜独特的香气。根据Guadagni 的香气值理论和已知化合物的香气阈值[13-15]，哈密瓜香气成分中峰面积大且香气阈值低的成分对香气的影响较大，它们很可能是特征香气。乙酸乙酯、乙酸丙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯、2-甲基丙酸乙酯和 2-甲基丁酸乙酯、壬醛是伽师瓜的主要香气成分，占酯类峰面积50.7%的乙酸酯类对构成伽师瓜的香气有关键作用[16]。

马永昆等[9]采用SPME 方法应用PDMS萃取头检测了哈密瓜汁中的香气成分，其中酯类有33种，醇类4种，醛类2种。本实验使用PDMS/DVB/CAR 50/30μm萃取头对哈密瓜中的香气成分进行富集，其中酯类有28种、醇类5种、醛类5种、烯烃类3种、酸类1种。结果表明PDMS/DVB/CAR 三相复合萃取头比单一极性的PDMS萃取头具有更宽的极性范围和更好的萃取效果。操君喜等[11]从哈密瓜样品中鉴定了12种成分，相对体积分数最多的是呋喃类物质，酮类和酸类分别占17%和23%，确定酯类及呋喃醇是哈密瓜香味的主体成分。本研究的挥发性成分在种类和数量上与马永昆有较大的差别，检测手段的进步和品种的不同都可能是产生这种差异的原因。

国内关于SPME方法应用于哈密瓜香气成份的文献中缺少对方法实验参数的系统研究。本实验结合HSSPME-GC-MS技术对伽师瓜果汁香气成分的实验参数萃取温度、萃取时间、盐添加量进行正交试验，以峰面积为判定指标进行直观分析；并在此优化条件基础上，进行方法线性范围、回收率、检出限等实验，较为系统的建立了一个SPME应用于哈密瓜香气成份分析的方法。本研究使用GC-MS鉴定哈密瓜果汁挥发性芳香物质并根据Guadagni的香气值理论和已知化合物的香气阈值进行了系统分析。

但是GC-MS作为一种间接的测量方法，并不能用来有效分析出所有香味活性的化合物，此外，GC-MS无法用来确定各种香味化合物对哈密瓜总体香味贡献的大小，因而也就无法确定对哈密瓜香味起作用的一些关键香味化合物。气相色谱-嗅闻技术(GC-O)是解决这些问题的一种理想的方法，在SPME方法的基础上结合GC-O技术鉴别哈密瓜特征香味化合物及确定哈密瓜香味化合物的香味强度和作用是今后研究的重点。

3 结 论

确定了H S-S P M E哈密瓜风味物质分析中应用PDMS/DVB/CAR 50/30μm萃取头，加入饱和电解质NaCl 2.4g(即0.3g/mL)，在40℃萃取40min，GC谱图峰面积最大，哈密瓜VFC萃取和检测效果最好。

该方法加标回收率在86.8%和97.6% 之间，线性范围、最小检测限分别为8.24～217ng/mL和7.21ng/mL，方法操作灵敏性和重现性好。

哈密瓜果汁HS-SPME-GC-MS 研究表明，主要的VFC 包括醛类、醇类、酯类和烯烃类化合物等，在已鉴定的42个化合物中乙酸乙酯、乙酸丙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯、2-甲基丙酸甲酯、2-甲基丙酸乙酯和 2-甲基丁酸乙酯等为主要的呈香物质。

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Headspace Solid-phase Microextraction Followed by GC-MS Analysis of Volatile Flavor Composition of Hami Melon

JIA Kai1，HU Xiao-song1，LIAO Xiao-jun1，ZHANG Ming-wei2，CHEN Fang1，WU Ji-hong1,*
(1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Key Laboratory of Fruits and Vegetables Processing, Ministry of Agriculture, Engineering Research Centre for Fruits and Vegetables Processing, Ministry of Education, Beijing 100083, China；2. Sericulture and Agro-processing Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510610, China)

The optimal conditions (namely NaCl amount and extraction temperature and time) for the headspace solid-phase microextraction (HS-SPME) of volatile flavor components from Jiashi muskmelon, one cultivar of Hami melon were investigated by single factor and orthogonal array design methods. The optimized HS-SPME was coupled with GC-MS to develop a method for the analysis of volatile flavor composition of Jiashi muskmelon. Results showed that the use of a PDMS/DVB/CAR fiber for the 40 min extraction at 40 ℃ of Jiashi muskmelon with NaCl added as electrolyte at 2.4 g/mL gave an optimal extraction of volatile flavor components from Jiashi muskmelon. The developed analytical method exhibited spike recoveries for ethyl 2-methylbutyrate, octanal, hexyl acetate and n-butyl acetate varying from 86.8% to 97.6%, a liner range from 8.24 to 217 ng/mL and a minimum detectable quantity of 7.21 ng/mL and demonstrated high sensitivity and reliability. Forty-two compounds were identified in Jiashi muskmelon, in which, the predominant compounds were ehyl aetate, n-popyl acetate, popanoic acid, 2-methyl-, ethyl ester, btan oic acid, ethyl ester, btanoic acid, 2-methyl-,ethyl ester, hxanoic acid, ethyl ester, aetic acid, hexyl ester and nonanal.

headspace solid-phase microextraction (HS-SPME)；orthogonal array design；volatile flavor compound (VFC)；Jiashi muskmelon

TS255.2

A

1002-6630(2010)10-0239-05

2009-08-03

贾恺(1985—)，男，硕士研究生，研究方向为风味化学。E-mail：tjujiakai@gmail.com

*通信作者：吴继红(1964—)，女，副教授，博士，研究方向为风味化学。E-mail：wjhcau@yahoo.com.cn