水产品金黄色葡萄球菌检验结果不确定度的评定

王李宝，凌 云，刘绿叶，沈 辉，万夕和

(江苏省海洋水产研究所，江苏 南通 226007)

水产品金黄色葡萄球菌检验结果不确定度的评定

王李宝，凌 云，刘绿叶，沈 辉，万夕和

(江苏省海洋水产研究所，江苏 南通 226007)

目的：评定水产品金黄色葡萄球菌检验结果的不确定度。方法：采用统计学方法对日常检验数据进行不确定度评定。结果：扩展不确定度为0.1，适合于每一个水产品样本的检测结果。结论：利用日常检验数据评定金黄色葡萄球菌检验结果的不确定度是可行的。

水产品；金黄色葡萄球菌；不确定度评定

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种引起人类和动物化脓感染的重要致病菌，也是造成人类食物中毒的常见致病菌之一[1-2]。为了确保金黄色葡萄球菌检验结果的准确性和可靠性，尝试将其检验结果不确定度的评定引入到日常的检验工作中。而测量不确定度是衡量测试结果准确性和可靠性的重要参数。测量结果不确定度评定是实验室质量体系的重要组成部分，是测量实验室质量管理的重要内容，也是ISO/IEC17025的要求。尤其当不确定度影响到与规范限度的符合性时，测量不确定度的信息显得特别重要[3-4]。检验结果的可用性很大程度上取决于测量结果不确定度的大小。所以，检验结果不确定度的评定对实验方法的可靠性有科学的指导意义[5-6]。

本研究采用GB/T 4789.37—2008《食品卫生微生物学检验：金黄色葡萄球菌计数》中的第一法[7]对本实验室抽检的南通地区2007～2009年的水产品(干紫菜)金黄色葡萄球菌进行检验，找出影响输入量的各种因素，计算各种不确定度分量，计算合成不确定度和扩展不确定度，从而对检验结果的质量给出定量的说明，以确定检验结果的可信程度，进而掌握类似检验方法的测量不确定度的评定程序。

1 评定方法的选择

假设检验样品是均匀的，在实验室内由相同人员在同一检验环境按同一检验标准进行检验。鉴于检验过程对样品进行10倍稀释，因此对检出金黄色葡萄球菌的检验结果取对数，再用统计学方法(A类)评定此类样品的金黄色葡萄球菌计数检验结果的不确定度。

2 检验方法和检验流程

2.1 试剂与仪器

本研究中所采用的培养基均采购于北京陆桥技术有限责任公司，所用主要仪器有恒温培养箱和电子天平等，均符合GB/T 4789.37—2008计数中试剂和仪器的要求。

2.2 样品中金黄色葡萄球菌的计数

根据GB/T4789.37—2008计数中第一法进行检验。

2.3 结果计算

根据GB/T 4789.37—2008中第一法的计算方法。

3 不确定度分量的主要来源及分析

检验结果的不确定度来源如图1所示。

图1 检验结果的不确定度来源Fig.1 Analysis of source of measurement uncertainty in the enumeration of Staphylococcus aureus in aquatic products

4 不确定度的评定

4.1 样品称量过程产生的不确定度

本实验室严格依照GB/T 4789.1—2008《食品卫生微生物学检验：总则》[8]规定，在无菌条件下将样品充分混匀后随机取样，均质袋拍击速度和拍击时间严格按照GB/T 4789.37—2008中规定执行。

GB/T 4789.37—2008要求准确称量25g被测样品，本实验室采用精度为0.01g的电子天平，根据JJG1036—2008《中华人民共和国计量检定规程：电子天平》规定[9]，该准确级(Ⅱ)的天平在0～500g称量范围的MPE为±0.5g，天平线性MPE为矩形分布，天平称量引入的不确定度为：

4.2 样品稀释过程中仪器所产生的不确定度

样品稀释采用1mL移液器和10mL移液管进行梯度稀释。JJG646—2006《中华人民共和国计量检定规程移液器检定规程》[10]规定：1000μL可调移液器吸取1mL时容量允差为±1.0%，取矩形分布；JJG196—2006《中华人民共和国计量检定规程常用玻璃量器》[11]规定：20℃时10mL移液管(A级)的容量允差为±0.05mL，取矩形分布。因此，由可调移液器及吸管导致的不确定度分别为：

因此，样品稀释过程中所产生的不确定度为：

本实验是在20℃的条件下进行的，因此，容量瓶和溶液温度与校准时温度不同引起的不确定度为零。当温度不为20℃时，必须考虑温度对体积的影响。

4.3 样品重复性检验的不确定度

在相同条件下，对同一份金黄色葡萄球菌污染的样品进行了10次独立检验，检验结果为1.25×102、1.3 ×102、1.25×102、1.3×102、1.4×102、1.25×102、1.25×102、1.25×102、1.25×102、1.25×102CFU/g。为了计算不确定度的方便将上述结果均取对数，相应结果为2.10、2.11、2.10、2.11、2.15、2.10、2.10、2.10、2.10和2.10。金黄色葡萄球菌计数结果的对数算术平均值为：

4.4 培养基储存条件产生的不确定度

表1 BP培养基在不同贮存条件下对金黄色葡萄球菌检测结果的影响Table 1 Effect of storage conditions of Barid-Parker culture medium on the enumeration of Staphylococcus aureus

即使由同一厂家生产的Barid-Parker培养基因储存条件和时间不同，导致金黄色葡萄球菌的检出率不同[12]。本实验室按照GB/T 4789.37—2008附录A.2规定配制Barid-Parker培养基，在48h内对同一金黄色葡萄球菌污染样品使用不同贮存条件下(室温和冰柜贮存)的Barid-Parker培养基平板进行了检测，检测结果见表1。

室温(18～22℃)条件下，金黄色葡萄球菌检出率算术平均值为：

4.5 肉眼读数的偏差产生的不确定度

对于平板上超过150个菌落，本实验室检验人员通常采用两种计数方式：一、直接计数，即逐个点数平板上的可疑菌落数，二、将平板等分四等分，点数其中一个区域的可疑菌落数，再乘以4倍得菌落总数。本实验室采用受金黄色葡萄球菌污染的不同样品进行了20次检验，采用上述两种读数方法，检验结果见表2。

表2 不同方法的金黄色葡萄球菌检测结果Table 2 Results of enumeration of Staphylococcus aureus obtained by different colony counting methods

20次不同计数方式，等分计数结果/直接计数结果的平均值为：

4.6 血浆凝固酶阳性比例产生的不确定度

由于可疑菌落需要进行血浆凝固酶实验来最终判定金黄色葡萄球菌的比例，故血浆凝固酶实验也可产生不确定度。根据2008年至2009年本实验室统计，共计完成血浆凝固酶验证实验135次，其中1次阳性率为80%，其余验证结果阳性率均为100%，则135次验证实验金黄色葡萄球菌阳性率平均值为：

单次检验的不确定度为：

所以，由血浆凝固酶实验引入的不确定度为：

4.7 样品的合成不确定度

4.8 扩展不确定度

在没有特殊要求的情况下，按一般惯例，测量结果的扩展不确定度包含因子k取2，则相对扩展不确定度为：

4.9 结果报告

当检验结果以对数的平均值表示时，其取值区间分布于±0.21。当检测结果以平均值表示时，相对于对数值的取值再取反对数得其取值区间分布。

5 结 论

采用GB/T 4789.37—2008中第一法检验水产品中金黄色葡萄球菌，在检出金黄色葡萄球菌样品的检验结果中，其对应的计数结果对数值的扩展不确定度为0.1。该样品金黄色葡萄球菌的检验计数结果为：ω＝10(2.11±0.21)CFU/g，即ω＝(79～209)CFU/g。

经过本实验室对金黄色葡萄球菌检验结果分析得出，按照GB/T 4789.37—2008中第一法中的检验方法和实际操作，此次检验结果的不确定度主要来源是：肉眼读数的偏差、培养基贮存条件、样品称量过程、稀释过程等因素。

对各不确定度分量进行分析和计算表明，肉眼读数偏差产生的不确定度分量最大，其次是培养基贮存条件引入的不确定度，再次是血浆凝固酶验证实验和称量引入的不确定度，相对较小的是样品稀释过程和实验重复性引入的不确定度。

因此，以后对于样品金黄色葡萄球菌的检验，尽量采用逐个点数可疑菌落，并在尽可能短的时间内使用所配制的Barid-Parker培养基，是确保检测数据准确、可靠的有效手段。

[1]雷柞荣. 葡萄球菌毒素和葡萄球菌毒素病[M]. 北京: 中国科学技术出版社, 1992.

[2]崔京辉, 李达, 王丽萍, 等. 2004-2006年北京市西城区食品中主要致病菌株检测结果及分析[J]. 中国卫生检验杂志, 2008, 18(6): 1163-1165.

[3]许如苏, 马少玲, 陈冠武. 奶制品霉菌和酵母计数检验结果不确定度的评定[J]. 中国卫生检验杂志, 2007, 17(7): 1247-1248.

[4]卢济深. 测量仪器示值误差的不确定度及其应用[J]. 中国计量, 2008 (7): 88-90.

[5]敬思群, 刘长勇, 刘军. HLPC测定鸡肉中呋喃唑酮的不确定度分析[J]. 食品科学, 2007, 28(12): 394-396.

[6]黎吴雁, 杨更发, 扬宁敏, 等. 微生物检测质量控制标样不确定度的评定[J]. 中国食品工业, 2009(3): 62-63.

[7]中国疾病预防控制中心营养与食品安全所. GB/T 4789.37—2008食品卫生微生物学检验 金黄色葡萄球菌计数[S]. 北京: 中国标准出版社, 2009.

[8]中国疾病预防控制中心营养与食品安全所. GB/T 4789.1—2008 食品卫生微生物学检验 总则[S]. 北京: 中国标准出版社, 2009.

[9]中国计量科学研究院. JJG 1036—2008中国人民共和国国家计量检定规程 电子天平[S]. 北京: 中国计量出版社, 2008.

[10]全国流量容量计量技术委员会. JJG646—2006中华人民共和国国家计量检定规程 移液器[S]. 北京:中国计量出版社, 2007.

[11]全国流量容量计量技术委员会. JJG 196—2006中华人民共和国国家计量检定规程 常用玻璃量器[S]. 北京: 中国计量出版社, 2007.

[12]张文利, 刘月芳. BP培养基经不同条件贮存后对金黄色葡萄球菌检测结果的影响[J]. 中国卫生检验杂志, 2005, 15(5): 620-621.

Evaluation of Measurement Uncertainty in the Enumeration of Staphylococcus aureus in Aquatic Products

WANG Li-bao，LING Yun，LIU Lu-ye，SHEN Hui，WAN Xi-he
(Institute of Oceanology and Marine Fisheries, Nantong Jiangsu 226007, China)

To make an evaluation on measurement uncertainty in the enumeration of Staphylococcus aureus in aquatic products, the sources of measurement uncertainty were analyzed, each uncertainty component was modeled and an integrated uncertainty model as a function of all components was established and expanded. The expanded uncertainty was calculated to be 0.1. The evaluation is a good fit for each aquatic product sample.

aquatic products；Staphylococcus aureus；uncertainty evaluation

TS254.1

A

1002-6630(2010)10-0212-04

2009-08-14

江苏省社会发展科技计划(面上)项目(BS2006029)

王李宝(1978—)，男，助理研究员，硕士，主要从事海洋微生物学研究。E-mail：zebra_w@126.com