高效液相色谱法测定南瓜果肉中胡芦巴碱含量

徐雅琴，王 翀，崔崇士

(1.东北农业大学理学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.东北农业大学园艺学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

高效液相色谱法测定南瓜果肉中胡芦巴碱含量

徐雅琴1，王 翀1，崔崇士2

(1.东北农业大学理学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.东北农业大学园艺学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

以脱脂南瓜粉为原料，70%乙醇溶液为溶剂，微波辅助萃取样品中的胡芦巴碱，建立南瓜果肉中胡芦巴碱含量的高效液相色谱(HPLC)检测方法。实验过程中，采用的色谱柱为Agilent-ZORBX SB-C18(4.6mm×150mm，5μm)柱，流动相为0.40mmol/L磷酸溶液(pH3.2)，流速为0.6mL/min，进样量为10μL，检测波长265nm，柱温为室温。研究结果表明，胡芦巴碱在5.6～134.4μg/mL范围内具有良好的线性关系，相关系数r=0.9999(n=5)；平均回收率为97.09%，RSD为1.02%(n=5)。本法简便、准确、重复性好，可用于南瓜果肉中胡芦巴碱的含量测定。此外，采用此方法测定了13个品种南瓜果肉中胡芦巴碱的含量，结果表明胡芦巴碱含量为172.5～475.5μg/g。

南瓜；胡芦巴碱；高效液相色谱法(HPLC)

南瓜，又名倭瓜、番瓜、饭瓜、窝瓜等，胡芦科南瓜属的一年生蔓性草本植物，以其营养价值极高被世界营养学家公认为是21世纪的保健食品[1]。南瓜的果实、茎、叶、花朵和种子中含有丰富的类胡萝卜素、南瓜多糖、抗菌活性蛋白、降血糖多肽物质等[2-4]。除此之外南瓜果肉含有生物碱——胡芦巴碱。胡芦巴碱是一种植物激素类活性成分，具有抗肿瘤作用及降血糖活性，还可有效治疗一些皮肤疾病，例如牛皮癣[5-9]等。

目前有关胡芦巴碱的定量方法文献上报道主要采用高效液相色谱法(HPLC)[10-15]，南瓜中胡芦巴碱含量的测定国内仅见张春英等[11]报道采用正相氨基键合相色谱柱，以乙腈-水(80:20)为流动相，得到了较好的分离效果。本实验以南瓜果肉为试材，采用反向C18色谱柱，确定HPLC的测定条件，拓展南瓜果肉中胡芦巴碱含量测定的HPLC方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

方法探讨实验用市售南瓜，方法应用实验南瓜由东北农业大学南瓜研究所提供。

甲醇(色谱纯)；磷酸(色谱纯)；胡芦巴碱对照品 中国药品生物制品检定所，其他试剂均为分析纯。

H P 1 1 0 0型高效液相色谱仪[配置四元梯度泵(G 1 3 1 4 A)、自动进样器(G 1 3 1 3 A)、紫外检测器(G1314A)、ZORBX SB-C18柱(4.6mm×150mm，5μm)]美国Agilent公司；XH-100A微波催化合成/萃取仪 北京祥鹄科技发展有限公司；R-205旋转蒸发仪 上海申生生物技术有限公司。

1.2 原料预处理

将南瓜洗净后，去皮、去瓤、切片、烘干、粉碎成粉后备用。

1.3 色谱条件的选择

采用Agilent-ZORBX SB-C18色谱柱(4.6mm× 150mm，5μm)，检测波长为265nm，柱温为室温，进样体积10μL，流速为0.6mL/min分别考察不同比例的甲醇-水、乙腈-水及磷酸溶液作为流动相时对分离效果的影响。

1.4 样品处理

将南瓜粉过40目筛后，置索氏提取器中，加无水乙醚连续回流12h脱脂，得脱脂南瓜粉。挥尽乙醚后精密称取约5g的脱脂南瓜粉，加70%乙醇溶液100mL，微波萃取7min，过滤，乙醇沉后再次过滤，回收乙醇[16]。提取物用甲醇溶解，定容于25mL容量瓶中。0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

1.5 标准溶液的配制

胡芦巴碱对照品约10mg，精密称取，置于10mL容量瓶中，甲醇定容，最后得到质量浓度为1.12mg/mL的对照品储备液，4℃冰箱存放。分别精密吸取储备液0.05、0.2、0.4、0.8、1.2mL于10mL容量瓶中，甲醇稀释并定容，摇匀配制成质量浓度分别为5.6、22.4、44.8、89.6、134.4μg/mL系列对照品溶液，进行液相色谱分析，绘制标准曲线。

1.6 方法学考察

对所建立测定方法的稳定性、重现性、精密度、回收率进行评价。

1.7 样品测定

按1.4节样品处理方法对13个品种的南瓜进行处理，进行液相色谱分析，进样量10μL，采用外标法定量，测定胡芦巴碱的含量。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的确定

实验结果表明：当流动相选择不同比例的甲醇-水、乙腈-水溶液作为流动相都不能将样品中的胡芦巴碱与其他物质进行分离。当流动相采用0.40mmol/L磷酸溶液(pH3.2)溶液时，分离效果较好，其对照品和样品的色谱图如图1所示。

图1 对照品(A)及样品(B)的HPLC谱图Fig.1 HPLC chromatograms of trigonelline standard and a pumpkin pulp sample

由图1可看出，对照品和样品的出峰时间分别在3.165nm和3.167nm，基本一致，而且样品中胡芦巴碱与相邻物质的分离效果较好。因此确定流动相为0.40mmol/L磷酸溶液(pH3.2)。

2.2 线性范围的考察

分别取胡芦巴碱含量为5.6、22.4、44.8、89.6、134.4μg/mL的标准溶液，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，按色谱条件1.3节进行分析，以对照品质量浓度(μg/mL)为横坐标(X)、对照品峰面积为纵坐标(Y)，绘制工作曲线。结果得到回归方程：Y=22.381X +59.627，相关系数r=0.9999(n=5)。表明对照品溶液在5.6～134.4μg/mL内呈现良好的线性关系。

2.3 稳定性实验

取同一供试品溶液，按所建立的方法进样分析，分别在0、2、4、8、1 2、2 4、4 8、9 6 h测定峰面积，平均值为881.9，相对标准偏差(RSD)为0.27% (n=5)。表明供试品溶液在96h内基本稳定。

2.4 重现性实验

精密称取5份脱脂南瓜粉样品，质量分别为5.0132、5.0096、4.9982、5.0201、5.0105g，样品按1.4节方法

处理，进样分析，测定胡芦巴碱含量分别为186.1、182.4、178.9、189.6、181.7μg/g，平均含量为183.7μg/g，RSD为2.27%(n=5)。该结果表明方法重现性好。

2.5 精密度实验

取同一供试品溶液，按1.3节色谱条件重复进样5次，测定峰面积，结果分别为876.4、872.9、875.8、874.1、869.7，平均值为873.8，RSD为0.31%(n=5)。表明该方法精密度很高。

2.6 回收率实验

精密称取6份已知含量的脱脂南瓜粉样品约2.5g，分别精密加入对照品储备液0.2、0.2、0.4、0.4、0.6、0.6mL，挥尽甲醇，按1.4节样品处理方法制备供试品溶液，按照上述色谱条件进样分析，结果见表1。

表1 回收率实验结果(n=5)Table 1 Average recovery for trigonelline in a total of 6 real samples spiked at 3 levels repeated twice each in 5 replicates

表1测量结果表明，加样回收实验中在胡芦巴碱出峰时间处没有意外峰出现，说明供试品种含有与对照品出峰时间相同的物质。平均回收率为97.09%，RSD为1.02%，满足测定要求。

2.7 不同南瓜品种胡芦巴碱含量的测定

表2 不同南瓜品种中胡芦巴碱的含量Table 2 Results of determination of trigonelline in different cultivars of pumpkin powder by the method

不同品种南瓜果肉中胡芦巴碱的含量测定结果见表2。结果表明，所测脱脂南瓜粉中胡芦巴碱的含量为172.5～475.5μg/g。

3 结 论

本实验首次采用反相C18色谱柱，建立南瓜果肉中胡芦巴碱含量的测定方法。本测定方法操作简便、准确、灵敏度高、重复性好，可用于对南瓜果肉中胡芦巴碱成分的定性与定量的分析。

[1]刘软枝, 赵玉安. 南瓜的功能特性[J]. 中国食物与营养, 2006(3): 47-48.

[2]黄黎慧, 黄群, 于美娟. 南瓜的营养保健价值及产品开发[J]. 现代食品科技, 2005, 21(3): 176-179.

[3]孔谨, 李新峥, 周俊国, 等. 南瓜综合深加工及新型功能性食品的开发前景与技术研[J]. 食品研究与开发, 2004, 25(5): 72-74.

[4]王洪伟, 徐雅琴. 南瓜功能成分研究进展[J]. 食品与机械, 2004, 20 (4): 55-56.

[5]朱宝立, 班永宏, 段金廒. 胡芦巴对急性化学性肝损伤的保护作用[J]. 中国工业医学杂志, 2000, 13(1): 19-21.

[6]AGARWAL J S, RASTOGI R P. Chemical examination of water soluble fraction of Mappia foetida Miers[J]. Indian J Chem, 1975,13(7): 758-759.

[7]MAI J, MAI H. Treatment of skin diseases with trigonelline: Germany, 3915535[P]. 1990-11-15.

[8]MAI J. Oral hair growth stimulant based on fenugreek extract: Germany, 273379[P]. 1989-11-15.

[9]STUECKLER E. Compositions comprising trigonelline and vita-minB6 for hair,nail and skin care: Germany, 4012148[P]. 1990-10-31.

[10]TRUGO L C, MACRAE R, DICK J. Determination of purine alkaloids and trigonelline in the instant coffee and otherbeverage using highperformance liquid chromoto-graphy[J]. J Sci Food Agri, 1983, 34(3): 300-306.

[11]张春英, 杨鑫, 张华, 等. 高效液相色谱法测定南瓜粉中胡芦巴碱的含量[J]. 食品科学, 2008, 29(1): 280-282.

[12]姜舜尧, 田颂九. 用高效离子交换色谱法分析使君子药材中胡芦巴碱成分[J]. 中国中药杂志, 2004, 29(2): 135-137.

[13]赵怀清, 曲燕, 王学娅, 等. 胡芦巴碱的HPLC法测定及药代动力学研究[J]. 药学学报, 2003, 8(4): 279-282.

[14]曲燕, 赵怀清, 张洪建, 等. HPLC法测定雀巢速溶咖啡中胡芦巴碱的含量[J]. 沈阳药科大学学报, 2001, 18(6): 422-444.

[15]宋粉云, 张德志, 钟运香, 等. HPLC法测定紫茉莉根中葫芦巴碱的含量[J]. 中国新药与临床药理, 2005, 16(3): 189-191.

[16]王翀, 徐雅琴. 微波辅助萃取南瓜胡芦巴碱工艺的优化[J]. 食品工业科技, 2009, 30(1): 258-262.

HPLC Determination of Trigonelline in Pumpkin Pulp

XU Ya-qin1，WANG Chong1，CUI Chong-shi2
(1. College of Science, Northeast Agricultual University, Harbin 150030, China；2. College of Horticulture, Northeast Agricultual University, Harbin 150030, China)

A method for the determination of trigonelline in pumpkin flesh was established using high performance liquid chromatography (HPLC). Samples were defatted in a Soxhlet extractor with absolute ethyl ether as solvent and extracted with 70% aqueous ethanol with microwave assistance. An Agilent Zorbax SB-C18 column kept at ambient temperature was used for the chromatographic separation with 0.40 mmol/L aqueous solution of phosphoric acid (pH 3.2) as a mobile phase at a flow rate of 0.6 mL/min. The injection volume was 10 μ L. The detection wavelength was set at 265 nm. Results showed that the developed standard curve of trigonelline exhibited good linearity over the concentration of 5.6 to 134.4 μ g/mL, with a correlation coefficient of 0.9999 (n = 5). The average recovery for trigonelline in a total of 6 real samples spiked at 3 levels repeated twice each in 5 replicates was 97.09%, with a relative standard deviation of 1.02%. This method proved to be simple, accurate and of good repeatability so as to be most suitable for the determination of trigonelline in pumpkin pulp. Thirteen cultivars of pumpkin pulp were determined by the method to have very different trigonelline contents ranging between 172.5μ g/g and 475.5 μ g/g.

pumpkin；trigonelline；high performance liquid chromatography

TS218.1

A

1002-6630(2010)10-0209-03

2009-08-30

黑龙江省自然科学基金资助重点项目(ZJN0606-01)；黑龙江省教育厅科学技术研究项目(11521028)

徐雅琴(1964—)，女，教授，硕士，主要从事天然产物及其开发研究。E-mail：xu-yaqin@163.com