酶膜生物反应器制备抗凝血酶蛋清水解物的研究

杨万根，程云辉，王 璋

(1.徐州工程学院食品工程学院，江苏 徐州 221008；2.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122；3.长沙理工大学化学与生物工程学院，湖南 长沙 410114)

酶膜生物反应器制备抗凝血酶蛋清水解物的研究

杨万根1,2，程云辉3，王 璋2

(1.徐州工程学院食品工程学院，江苏 徐州 221008；2.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122；3.长沙理工大学化学与生物工程学院，湖南 长沙 410114)

采用酶膜生物反应器(EMBR)制备抗凝血酶蛋清水解物，并用人工神经网络方法优化工艺。在0.13～0.15MPa条件下，采用L18(37×21)混合水平正交试验考察底物质量分数、酶质量分数、pH值、温度、滤过液流速和水解时间对蛋清水解物的抗凝血酶生物活性的影响，并用多层前馈网络(BP神经网络)对EMBR酶解的过程进行模拟和预测，获得抗凝血酶水解产物的最优制备工艺条件。结果表明，在底物质量分数1%、酶质量分数1%、pH8.0、温度55℃、滤过液流速10mL/min、水解时间4h时，产物的最低抗凝血酶IC50预测值为10.43mg/mL，与实测值仅相差4.03%，说明采用EMBR制备蛋清酶解物的方法可行，并经人工神经网络方法优化得到了抗凝血酶蛋清水解物的最优制备条件。

酶膜生物反应器；蛋清；多层前馈网络(BP神经网络)；抗凝血酶活性；优化

自1985年以来，我国鸡蛋产量就一直位居世界首位，在2005年鸡蛋产量已占世界产量的40%以上[1]。在一些食品行业中，蛋黄被用做糕点、月饼的原料，而蛋清常常作为废弃物被抛弃，既污染了环境，又浪费了宝贵的蛋白质资源。因此，开发和利用丰富的蛋清资源具有重要意义。蛋清是含有10.6%蛋白质的水溶液，当前开发蛋清的一种新途径是以蛋清蛋白质为原料，以生物酶解的方法制备具有一定生物活性的水解物用于各种运动营养品和保健食品中[2-3]。酶膜生物反应器(enzymatic membrane bioreactor，EMBR)是将膜过滤和酶催化反应结合在一起的系统，可以用于连续制备小分子蛋白质水解物，比目前常用的批次酶解法具有节省酶成本、底物转化率高及产物品质均一等优点[4-5]，是一种比较先进的方法，已被应用于制备各种

蛋白质来源的水解物[6-7]。

EMBR制备水解物的过程受到较多因素的影响，一般的优化方法例如响应面分析法，因实验工作量太大而不适合对E M B R酶解工艺进行优化。M a t l a b是Mathworks公司研制的一套高性能的数值计算和可视化软件，其中的人工神经网络工具箱是用Matlab语言开发出来的诸多工具箱之一，网络的设计者可以根据自己的需要去调用工具箱中有关人工神经网络的设计与训练函数，从而提高效率和解题质量。人工神经网络技术在多因素工艺优化方面具有降低工作量的优势[8]，如赵武奇等[9]用人工神经网络优化出最佳的苹果籽油乳化工艺参数；李兴江等[10]用神经网络分析秸秆水解液经发酵产琥珀酸的工艺，具有抗凝血酶活性的蛋白水解物可以用于防治心血管疾病病人发生血栓病，在医药和保健食品行业有着广阔的应用前景[11]。因此，本实验采用EMBR制备抗凝血酶蛋清水解物，并设计3层前馈网络(BP神经网络)，对制备过程进行模拟和预测，最终获得EMBR制备抗凝血蛋清水解物的最优生产工艺，为产业化EMBR酶法制备蛋清水解物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蛋清粉 自制；Protease N“Amano” Amano酶制剂公司；凝血酶(牛血清)、纤维蛋白原(牛血清) Sigma公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

超滤系统：配有BiomaxTM10聚醚砜超滤膜膜包(截留面积0.1m2，截留相对分子质量104)、PelliconTM-2 Mini膜夹具、Millipore蠕动泵 美国Millipore公司；Plus384酶标仪 美国Molecular Devices公司；夹套玻璃反应器无锡湖景玻璃仪器商店。

1.3 方法

1.3.1 酶解工艺

酶解工艺如图1所示。配好2L一定浓度的蛋清溶液，调节pH10，迅速升温至85℃并恒温30min；反应器夹套中的水温预先升至水解温度，将热处理好的1L蛋清溶液转入2L容积的反应器中，用强力搅拌机在500r/min速度条件下搅拌，使蛋清溶液冷却到水解温度并恒定。其余蛋清溶液作补液，在60℃恒温水浴中保温。调节反应器中的蛋清溶液达到预定的水解pH值，加入Protease N蛋白酶开始水解。在水解初始0.5h内，关闭超滤装置，使反应在反应器中进行，之后开启超滤装置。为了避免泵入水解液温度超过50℃而对膜包造成损害，超滤装置前加有冷凝装置；进样压力设定在0.13～0.15MPa；水解过程中添加蛋清补液使反应液体积不变，并滴加1mol/L的NaOH溶液使反应液pH值恒定；到达预定水解时间后，终止反应。

图1 蛋清酶解工艺示意图Fig.1 Sketch map showing the egg white protein hydrolysis in an enzymatic membrane reactor

1.3.2 正交试验设计

在前期研究基础上[12]，采用L18(37×21)混合水平正交试验考察底物质量分数(A)、酶质量分数(B)、pH值(C)、水解时间(D)、滤过液流速(E)、温度(F)对水解物抗凝血酶活性的影响，因素水平设计见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels in the L18(37×21) mixed-level orthogonal array design

1.3.3 BP神经网络的设计及训练

选用表1所得的正交试验结果中18组试验数据作为学习样本，6个酶解工艺参数作为输入，抗凝血酶活性指标为输出。以Matlab语言中的人工神经网络工具箱为工具进行编程，选用6个输入神经元(X1～X6)，18个隐含层神经元(P1～P18)和1个输出神经元(y)的BP神经网络(图2)。为方便计算，首先将参数进行归一化处理，分别用1～3代表试验中各因素的3个水平(表1)。隐含层采用对数S型传递函数(logsig)，输出层采用纯线性函数(p u r e l i n)，学习函数为带动向量的B P学习函数(l e a r n g d m)，训练函数为成比例的共轭梯度算法(trainscg)，设定指标的训练均方差为10-2，完成训练拟合步数小于10000步，组成训练集对网络进行训练。

图2 BP结构网络Fig.2 Architecture for BP neural networks

1.3.4 BP神经网络对酶解过程的模拟和优化

利用训练好的BP神经网络考察试验中重要因素对抗凝血酶活性的影响，并经过Matlab数值仿真得到最大输出条件，然后进行实验验证。

1.3.5 蛋白质含量测定

采用Lowry法[13]测定。

1.3.6 抗凝血酶活性测定

采用酶标仪法[14]测定。水解物的抗凝血酶活性用IC50值来表示，其定义为抑制50%的凝血酶活力所需的蛋清水解物浓度。

2 结果与分析

2.1 正交试验结果

表2 L18(37×21)混合水平正交试验结果Table 2 Arrangement of the L18(37×21) mixed-level orthogonal array design and experimental results of the antithrombin activity of EWH

蛋清中含有多种对蛋白酶有抑制作用的物质，如卵类黏蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制物、卵抑制物和卵固蛋白等[15]。由于这些抑制物的存在，导致水解蛋清所需的酶质量分数增大或者水解度不理想，因此必须在EMBR酶解蛋清前对蛋清进行热处理，以使其中的蛋白酶抑制物发生变性或部分变性而失去抑制能力，提高酶解效果。对蛋清热处理的另一个优点是可以通过调节pH值，在热处理中形成低黏性的溶液，使蛋清呈现出原先没有的良好流体性质，以有利于蛋清物料在管路中的传送、超滤和水解。已有研究表明，调节蛋清pH10进行30min的热处理能达到以上目的，因此试验中采用该条件进行水解前的热处理[16-17]。

热处理后的蛋清进行酶解的正交试验结果见表2，极差分析结果见表3。对表2中各因素的R值大小排序可知因素的重要性次序，但是，各因素的效应是否真正对试验有影响，还需将其R值与空列的R值比较，当因素的R值大于空列R值时才能说明该因素的效应存在。由表3显示，水解时间和底物质量分数的R值小于空列的R值，故它们的影响效应不明显，由此因素的重要性排序为滤过液流速＞酶质量分数＞pH值＞温度。由Ki值可知，对抗凝血酶活性而言，EMBR制备蛋清水解物的最佳工艺条件为底物质量分数1%、酶质量分数1%、pH8.0、水解时间4h、滤过液流速10mL/min、温度55℃。

表3 正交试验结果极差分析Table 3 Range analysis for the antithrombin activity of EWH with various hydrolysis conditions

2.2 BP神经网络的训练

图3 BP神经网络训练Fig.3 Training of BP artificial neural networks

利用Matlab的神经工具箱对图2的BP神经网络进

行训练，结果显示在迭代步数为2974时，均方差为0.00855164，达到了预定的均方差小于10-2(图3)，因此所建的BP神经网络能够在规定的跌代步数内达到预期的训练目标。

2.3 BP神经网络对酶解过程的优化

由极差分析结果可知，滤过液流速、酶质量分数和pH值对水解物的抗凝血酶活性有重要影响，但考虑到实际工作中滤过液流速和pH值的影响更为重要，因此使用BP神经网络考察滤过液流速与底物质量分数、pH值与底物质量分数对抗凝血酶活性的影响，进而确定滤过液流速、p H值和底物质量分数的最佳工艺参数，它们对抗凝血酶活性的影响见图4、5。

图4 BP神经网络考察pH值与底物质量分数对抗凝血酶活性的影响Fig.4 Effects of pH and substrate concentration on the antithrombin activity of EWH investigated using BP artificial neural networks

图5 BP人工网络考察滤过液流速与底物质量分数对抗凝血酶活性的影响Fig.5 Effects of filtration flow rate and substrate concentration on the antithrombin activity of EWH investigated using BP artificial neural networks

由图4可知，pH值和底物质量分数对抗凝血酶活性存在影响，在pH8.0、底物质量分数1%时有抗凝血酶活性的最低IC50值。由图5可知，底物质量分数和滤过液流速同样对抗凝血酶活性存在影响，在底物质量分数1%、滤过液流速10mL/min时有最低IC50值。经Matlab数值仿真，当pH8.0、底物质量分数1%、酶质量分数1%、滤过液流速10mL/min、温度55℃、水解时间4h时，得到BP神经网络预测的最低抗凝血酶活性IC50值为10.43mg/mL。经相同条件实验验证，产物的IC50值为10.85mg/mL，与预测值相差4.03%。从预测值和实测值的误差可以看出，训练得到的BP神经网络具有较好的预测性，可作为此水解过程的模拟和预测工具。

3 结 论

本研究发现EMBR制备蛋清蛋白水解物的各参数中，滤过液流速、p H值、酶质量分数和温度对抗凝血酶活性存在影响效应，并且利用人工神经网络对EMBR水解过程进行了控制和仿真，实现了EMBR制备蛋清水解物的模拟和预测，为今后EMBR制备蛋清水解物的中试实验提供参考。

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Use of Artificial Neural Networks for the Optimization of Preparation of Egg-white Hydrolysate with Antithrombin Activity in an Enzymatic Membrane Bioreactor

YANG Wan-gen1,2，CHENG Yun-hui3，WANG Zhang2
(1. College of Food Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China；2. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China；3. School of Chemical and Biological Engineering, Changsha University of Science and Technology, Changsha 410114, China)

An enzymatic membrane reactor designed based on the combination of membrane filtration and Protease N Amanocatalyzed hydrolysis was used to prepare egg-white hydrolysate (EWH) with antithrombin activity. A L18(37×21) mixed-level orthogonal array design was used to investigate the effects of substrate concentration, enzyme dosage, pH, temperature, filtration flow rate and length of hydrolysis on the antithrombin activity of EWH. This was followed by the stimulation and predication of EW hydrolysis using back propagation (BP) neural networks to obtain the optimal values of the above parameters. The results showed that the predicted value of IC50of EWH obtained under the following optimized conditions: substrate concentration 1%, enzyme dosage 1%, filtration flow rate 10 mL/min, and length of hydrolysis 4 h was 10.43 mg/mL, 4.03% lower then the actual value. This demonstrates good reliability of BP neural networks in optimizing egg white protein hydrolysis.

enzymatic membrane bioreactor；egg white；back propagation (BP) neural network；antithrombin activity；optimization

TS253.9

A

1002-6630(2010)10-0159-04

2009-08-07

杨万根(1974—)，男，讲师，博士，研究方向为生物技术在食品中的应用。E-mail：yangwangen08@163.com