小米中VB2提取方法研究及其含量测定

董永刚，王 玲*，刘立丹，李 庆

(1.河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071001；2.河北农业大学理学院，河北 保定 071001)

小米中VB2提取方法研究及其含量测定

董永刚1，王 玲2,*，刘立丹2，李 庆1

(1.河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071001；2.河北农业大学理学院，河北 保定 071001)

通过单因素试验和正交试验分析研究不同提取液、提取方法和提取条件对小米中VB2提取效果的影响。采用荧光分析法，在激发波长λex=471.0nm和发射波长λem=528.0nm时，测定小米中VB2的含量。结果表明：选取H3PO4溶液为提取液，用水浴回流法，提取液浓度0.1mol/L、提取时间45min、提取液pH5.0时，提取效果最佳，且回收率可达到89.20%～100.32%，变异系数可控制在1.21%内。实验精密度和准确度良好，可快速、准确的测定小米中VB2含量。

小米；VB2；正交试验；荧光分光光度法

VB2是体内一些氧化还原酶的辅基，广泛参与体内各种氧化还原反应，能促进糖、脂肪和蛋白质的代谢，对维持皮肤、黏膜和视觉的机能有一定的作用。VB2体内不能合成，小米是膳食中VB2的主要来源，因此测定小米中VB2具有重要的意义[1]。

常见的测定VB2的方法有高效液相色谱法[2-3]、荧光光度法[3-4]、毛细管电泳电化学法[5]、分光光度法等[6]。样品的前处理是关键，它直接影响着VB2的提取效果，测量的精密度和准确度。VB2对热和酸稳定，易溶于酸，在碱性溶液中受光线照射很快转化为光黄素，常用的VB2提取液为盐酸、H2SO4和乙酸溶液。本实验拟筛选最适宜提取液，在荧光法分析的基础上对样品前处理条件进行改进和优化，简化了提取过程，降低了成本，并且提高VB2的提取效果，旨在为VB2的提取测定方法技术提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小米 市售。

VB2标准品 北京奥博星生物技术责任有限公司；淀粉酶 山东安克生物工程有限公司；3g/100mL KMnO4溶液；体积分数3% H2O2溶液；水为蒸馏水，试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

WFY-28型荧光分光光度计 天津拓普公司；pHS-23C数字型精密酸度计 上海雷磁仪器厂；感量1/万电子天平 上海梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准液的制备[7]

VB2于P2O5干燥器中干燥24h，准确称取0.0250g。溶解于0.02mol/L乙酸溶液中，在蒸汽浴上恒速搅动至溶解，冷却后定容至1L，标准液质量浓度为25mg/L，盛入棕色瓶加甲苯覆盖，低温(4℃)保存。

1.3.2 标准曲线绘制

取4.0mL标准溶液于100mL容量瓶中，定容。分别吸取2.5、5.0、7.5、10.0、12.5mL此溶液于50mL容量瓶中，摇匀后用0.1mol/L磷酸调至pH5.0，加蒸馏水定容至刻度。此系列标准液的质量浓度为50、100、150、200、250μg/L，依次测定其荧光强度，用所测结果绘制相对荧光强度与VB2溶液质量浓度(c)的标准曲线。

1.3.3 提取方法的选择

水浴回流法：样品经干燥后研磨，准确称取5.00g，于蒸馏瓶中，加入50mL 0.1mol/L磷酸，水浴回流45min，冷却至室温后，转至100mL锥形瓶中，加入含质量分数10%淀粉酶的2.5mol/L乙酸钠溶液5.0mL，摇匀，于培养箱中，37.5℃培养18h，调节pH5.0，使蛋白质充分沉淀，慢速滤纸抽滤，定容至100mL。用此方法测定VB2含量，重复3次，取平均值。

沸水浴法参考文献[8]方法；超声波法参考文献[9]方法；高压法参考文献[10]方法。

1.3.4 提取液的选择

分别以0.1mol/L三氯乙酸溶液、H2SO4溶液[7]、盐酸溶液[10]、H3PO4溶液、甲酸和乙酸溶液[11]为提取液，用水浴回流法提取小米中的VB2，每种方法重复3次，提取液经处理后测定VB2含量，比较6种提取液的提取效果，以选择提取效果较好的提取液。

1.3.5 提取条件对提取效果的影响

在单因素试验基础上，对提取时间、提取液浓度、提取液pH值3个因素各取3个水平，进行L9(34)正交试验[12]，以测定VB2含量作为指标进行考察，因素水平见表1。

表1 小米中VB2提取正交试验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for extraction of VB2from millet

1.3.6 样品测定

样品经干燥后研磨，准确称取5.00g，于蒸馏瓶中，加入50mL 0.1mol/L H3PO4溶液，水浴回流45min，冷却至室温后，转至100mL锥形瓶中，加入含质量分数10%淀粉酶的2.5mol/L乙酸钠溶液5.0mL，摇匀，于培养箱中，37.5℃培养18h，调节pH5.0，使蛋白质充分沉淀，慢速滤纸抽滤，定容至100mL。移取10mL于锥形瓶中，加1.0mL乙酸和1.0mL 质量分数3g/100mL的KMnO4溶液，静置2min，向试样中滴加0.5mL体积分数3%的H2O2溶液，摇匀，至溶液中无气泡产生[13]。

2 结果与分析

2.1 波长扫描

用移液管移取2mL标准溶液于100mL容量瓶中，定容后取10mL溶液于三角瓶中，调节pH5.0，用荧光分光光度计在400～600nm波长范围内进行扫描见图1。由图1可知，VB2的最佳激发波长λex=471.0nm，最佳发射波长为λem=528.0nm。

图1 VB2的激发(A)和发射(B)波长扫描Fig.1 Excitation(A) and emission(B) spectrum of VB2

2.2 标准曲线绘制

图2 VB2标准曲线Fig.2 Calibration curve of VB2

根据标准曲线(图2)得到回归方程为y=0.3186x+ 1.09，r=0.9993。VB2溶液在50～250μg/L范围内呈较好的线性关系。

2.3 提取液的选择

图3 不同提取液提取小米中VB2结果比较Fig.3 Comparison of VB2 in the millet with extracts

从图3可以看出，无机酸的提取效果优于有机酸提取，用H3PO4和H2SO4溶液提取效果较好，甲酸溶液提取效果最差，由此实验选取0.1mol/L 的H3PO4溶液为提取液。

2.4 提取方法的选择

图4 不同提取方法提取小米中VB2结果比较Fig.4 Yield of VB2 in the millet using different extraction methods

从图4可以看出，4种提取方法相比，超声波法提取效果最差，高压法和回流法标准偏差较小，提取效果较好，但是高压法需要把VB2还原成无荧光物质[10]，步骤较多，且多次重复测定结果表明回流法的精密度较高，且成本较低，所以实验选择回流法提取。

2.5 提取条件的选择优化

本实验选取H3PO4溶液作为提取液，则小米中VB2的提取效果主要受到提取液浓度、提取时间和提取液pH值3个因素的影响，经过正交试验(表2、3)可确定这3个影响因素对试验结果的影响大小，以优化提取条件，达到理想的测定结果。

表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 方差分析结果Table 3 Analysis of variance

由表2可见，各因素指标的极差均大于空列的极差，表明各因素效应对试验均产生影响，提取后溶液的pH值是影响VB2提取量的主要因素，H3PO4溶液浓度次之，提取时间最小。根据各指标的均值确定各因素的最佳水平组合为A1B3C2，即H3PO4溶液浓度为0.1mol/L，水浴回流45min，提取液pH5.0时，提取效果最佳。方差分析结果(表3)表明，提取液pH值对VB2的浸出量影响极显著，提取液浓度影响显著。

2.6 精密度实验

平行移取5份样品液做精密度测定，测得5份样品的平均值为3.14μg/g，标准偏差为0.038，变异系数较小为1.21%，用此法测定VB2含量，测定结果重复性好。

2.7 VB2含量及加标回收率测定

表4 两种测定方法结果比较Table 4 Comparison of two measurement methods of VB2

标准曲线法测定小米中VB2的含量，并与国标[7]测定结果比较，见表4，结果表明本方法与国标测定结果基本一致，但相对国标需要把VB2还原成无荧光物质[7]，本实验用水浴回流法提取小米中VB2实验操作简单、快速、成本较低。

2.8 回收率实验

表5 回收率实验结果Table 5 Results of recovery experiment

平行称取3份每份5.00g试样，分别加入0.20、0.25、0.30mL VB2标准溶液测定回收率， 3个样品的回收率测定结果，每个样品平行测定3次。由表5可见，本实验测定VB2的平均回收率为94.28%。

3 结 论

3.1VB2在酸性介质中较稳定，在酸解处理法中，酸浓度和时间对测定结果有一定影响，本实验以0.1mol/L H3PO4溶液为提取液，通过正交试验对酸解条件进行优化，与常用的盐酸溶液、乙酸溶液等提取液比较，提高了实验精密度和准确性。相对高压法需要把VB2还原成无荧光物质[10]，本实验用水浴回流法提取小米中VB2实验成本低，精密度和准确度良好，可快速、准确的测定小米中VB2含量。

3.2 样品经提取后，加入淀粉酶，培养箱中培养18h，使结合型VB2转变为游离型VB2，以达到理想的提取效果。提取液过滤后加入KMnO4溶液氧化其中杂质，排除干扰，提高测量的准确性。

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Extraction and Determination of Vitamin B2in Millet

DONG Yong-gang1，WANG Ling2,*，LIU Li-dan2，LI Qing1
(1. College of Food Science, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China；2. College of Science, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China)

Effect of the extraction method, solvent, solvent concentration, pH and time on the yield of vitamin B2in the millet was studied through single factor test and orthogonal design test. Vitamin B2content was determined by fluorophotometric method with excitation and emission wavelength at 471.0 nm and 528.0 nm, respectively. In the optimum extraction conditions, millet was extracted with 0.1 mol/L of aqueous H3PO4 at pH 5.0 for 45 min in a water bath backflow. Under such conditions, the recovery of VB2was from 89.20% to 100.32%, with the coefficient of variation 1.21%.

millet；vitamin B2(VB2)；orthogonal experiment；fluorophotometry

Q563.2

A

1002-6630(2010)24-0341-04

2010-03-03

董永刚(1981—)，男，硕士研究生，研究方向为食品化学。E-mail：dygysq@sina.com

*通信作者：王玲(1963—)，女，教授，研究方向为分析化学。E-mail：wanglinghbnd@163.com