云南栽培3种颜色玛咖中总生物碱含量分析

甘 瑾，冯 颖*，何 钊，徐珑峰，张 弘，陈晓鸣

(中国林业科学研究院资源昆虫研究所，云南 昆明 650224)

云南栽培3种颜色玛咖中总生物碱含量分析

甘 瑾，冯 颖*，何 钊，徐珑峰，张 弘，陈晓鸣

(中国林业科学研究院资源昆虫研究所，云南 昆明 650224)

建立云南栽培玛咖的总生物碱含量的分析方法，分析评价3种色型玛咖的总生物碱含量。分别采用酸性染料比色法和酸碱滴定法对云南栽培的3种色型玛咖的总生物碱含量进行测定。结果表明：酸性染料比色法灵敏度高，相对标准偏差较小，是玛咖总生物碱含量测定的适宜方法；紫色、白色和黄色3 种色型玛咖的总生物碱含量分别为4.4078、2.9193、2.2241mg/g，差异达到极显著水平(P＜0.01)；其中紫色玛咖的总生物碱含量最高，并与相关文献测定的来源于秘鲁的玛咖干粉的总生物碱含量相近。

玛咖；颜色；总生物碱；含量分析

玛咖(Lepidium meyenii Walp.)是生长在秘鲁海拔4000～4500米的安第斯山脉的一种十字花科植物，在安第斯山脉地区玛咖块根作为药食兼用的植物已有悠久的历史，传统用于提高性功能和生殖能力。现代大量研究表明玛咖具有抗疲劳、改善性功能、抗氧化、减少前列腺增生、缓解更年期综合症、抑制癌细胞、增加骨密度等多种功效[1]。国内外专家对玛咖的营养成分及次生代谢物质进行了较深入的研究，玛咖不仅含有蛋白、氨基酸、脂肪及微量元素等营养成分[2]，还含有多种次生代谢物质：玛咖烯(macaene)、生物碱(包括玛咖酰胺macamide)、芥子油苷及其水解衍生物、甾醇、多酚类及其他成分[3-5]，这些次生代谢物质被认为与玛咖的保健功效有密切关系[6-7]。玛咖独特全面的功效已受到世界保健食品行业的广泛关注。

我国玛咖栽培还未形成规模，玛咖产品及原料均来源于国外，笔者所在项目组几年前从秘鲁引种栽培，已在云南种植成功，形成了一定的规模和产量，保存有3个不同色型的品种，并对引种栽培玛咖的营养成分进行了分析与评价，分析表明云南栽培玛咖含有的营养成分与秘鲁产玛咖无本质区别，可以作为食品资源开发利用[8]；分析云南种植玛咖乙醇提取物的体外抗氧化活性，研究结果表明云南种植的3种颜色玛咖与原产秘鲁的玛咖一样具有抗氧化活性[9]，说明在云南不同地区具有发展玛咖种植产业的条件。

生物碱是一类重要的天然有机化合物，广泛地分布于植物界中，具有镇痛、消炎、降压、抗菌及抗癌等多种生理活性[10]，生物碱也是玛咖中重要的次生代谢物质之一，Muhammad等[5]对玛咖中的生物碱进行了研究，在玛咖干根的石油醚提取物中分离到两种酰胺类生物碱，其中一种命名为“macaridine”。Cui等[11]从玛咖根中分离出两种咪唑生物碱，并称它们具有选择性对抗人类癌细胞的细胞毒素活性。2004年在玛咖中又有5种新的酰胺类生物碱被分离鉴定[12]。McCollom等[13]对不同公司销售的玛咖产品中的玛咖酰胺(macamides)进行了定量分析，结果显示玛咖酰胺的含量范围为0.0016%～0.0123%。总生物碱含量定量分析的常用方法有酸碱滴定法和分光光度法，依据不同的原料应选择与其相适应的方法[14]。为了建立云南栽培玛咖总生物碱的定量分析方法，分析不同颜色玛咖总生物碱含量，本实验分别采用比色法与滴定法对玛咖总生物碱进行测定比较，对云南栽培的3种色型玛咖的总生物碱含量进行分析评价，并与相关文献进行对比，研究结果对云南玛咖高产高质栽培技术研究、功能活性成分的评价分析及云南栽培玛咖更好地开发利提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玛咖：块根颜色分别为紫色、黄色、白色的3种玛咖原料均来源于中国林科院资源昆虫研究所在云南省的引种栽培试验地，收获的玛咖块根清洗泥土后放入-5℃冰箱保存备用，紫色、黄色、白色玛咖含水率分别为52.00%、56.10%和55.2%。

苦参碱对照品 中国药品生物制品检定所；甲醇、氯仿、无水乙醇等试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DS-1型高速组织捣碎机 上海精科实业有限公司；AB204-S型电子分析天秤 瑞士梅特勒托利多仪器有限公司；N1000型旋转蒸发仪 日本东京理化仪器有限公司；GL-20B型高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；DU800型紫外可见光分光光度计 美国贝克曼库尔特有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玛咖总生物碱提取液的制备

将新鲜冷藏原料捣碎，取1g用甲醇20mL浸泡24h，过滤，取滤液为提取液。同法提取3次，合并提取液、浓缩为浸膏。然后用质量分数2% HCl溶液洗涤溶解，共洗涤3次，合并酸液，5000r/min离心10mim。取酸溶液，用质量分数10% NaOH调至pH10，再用等体积氯仿萃取3次，合并萃取液、浓缩并定容至10mL。

1.3.2 苦参碱对照品溶液的配制

称取苦参碱对照品10mg，精密称定，溶于氯仿溶液中，并定容至100mL，得到质量浓度为0.1mg/mL的对照品溶液。

1.3.3 溴麝香草酚蓝显色剂配制

称取溴麝香草酚蓝0.125g，精密称定，溶于1000mL的一定pH值的磷酸缓冲溶液中，显色剂浓度为2.0×10-4mol/L。缓冲溶液由0.2mol/L Na2HPO4·12H2O与0.2mol/L NaH2PO4·2H2O配制而成。

1.3.4 酸性染料比色法实验条件的确定

1.3.4.1 酸性染料比色法最大吸收波长扫描

取1.0mL氯仿溶液为空白，取黄色玛咖总生物碱提取液0.5mL和对照品溶液0.5mL，加氯仿至1.0mL，分别在空白、对照和样品溶液中加入2.0×10-4mol/L溴麝香草酚蓝显色剂6.0mL，氯仿5.0mL，密塞振摇2min，倒入分液漏斗中，静置2h，取氯仿层4.0mL，在氯仿溶液中加入无水硫酸钠(105℃干燥4h)0.2g，摇匀，放置10min，于300～700nm范围内扫描测定最大吸收波长。

1.3.4.2 溴麝香草酚蓝显色剂pH值的确定

取样品溶液6份，每份1.0mL，分别加入pH值为6.8、7.0、7.2、7.4、7.6的2.0×10-4mol/L溴麝香草酚蓝显色剂6.0mL，氯仿5.0mL，密塞振摇2min，倒入分液漏斗中，静置2h，取氯仿层4.0mL，在氯仿溶液中加入无水硫酸钠0.2g，摇匀，放置10min，于最大吸收波长处测定吸光度。

1.3.4.3 溴麝香草酚蓝显色剂用量的确定

取样品溶液7份，每份1.0mL，分别加入pH7.0的2.0×10-4mol/L溴麝香草酚蓝显色剂2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mL，氯仿5.0mL，密塞振摇2min，倒入分液漏斗中，静置2h，取氯仿层4.0mL，在氯仿层中分别加入无水硫酸钠0.2g，摇匀，放置10min，于最大吸收波长处测定吸光度。

1.3.5 标准曲线的绘制

准确吸取苦参碱对照品溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL，分别加入氯仿至1.0mL，再加入pH7.0的2.0×10-4mol/L溴麝香草酚蓝显色剂5.0mL，氯仿5.0mL，密塞振摇2min，倒入分液漏斗中，静置2h，取氯仿层4.0mL，在氯仿层中分别加入无水硫酸钠0.2g，摇匀，放置10min，以未加苦参碱的试验样为空白对照，于最大吸收波长处测定吸光度。以苦参碱对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得出线性回归方程。

1.3.6 酸性染料比色法测定样品生物碱含量

每种颜色样品取6份，每份1.0g，按照1.2.1节的方法进行生物碱的提取，然后分别取样品氯仿提取液，紫色、白色和黄色样品生物碱氯仿提取液的取样量分别为0.3、0.5、0.5mL，按照1.2.5节的方法进行测定。根据回归方程计算样品生物碱含量，并计算RSD。

1.3.7 酸碱滴定法测定样品生物碱含量

每种样品取6份，每份1.0g，按照1.2.1节方法进行生物碱的提取，所得氯仿提取液用60℃水浴蒸干。然后加入5.0mL无水乙醇溶解，加入0.01mol/L H2SO4溶液15mL，甲基红指示液3滴，用0.02mol/L NaOH溶液滴定至黄色。读取消耗的NaOH溶液的量，计算消耗H2SO4的量，并计算总生物碱的含量(每1mL H2SO4溶液(0.01mol/L)相当于4.967mg的苦参碱)。

1.3.8 数据处理

实验数据采用SPSS 软件(13.0 版)进行方差分析的显著性检验。

2 结果与分析

2.1 酸性染料比色法测定条件的确定

2.1.1 最大吸收波长确定

图1 样品溴麝香草酚蓝显色后波长扫描Fig.1 UV-visible absorption spectrum of the sample

图2 对照品溴麝香草酚蓝显色后波长扫描Fig.2 UV-visible absorption spectrum of the standard sample

扫描结果如图1、2所示，样品波长扫描曲线的最大峰值为414.0nm，对照品的最大峰值为411.5nm，样品与对照品的最大峰略有差异，以样品最大吸收波长为标准，因此选择414nm为测定波长。

2.1.2 溴麝香草酚蓝显色剂pH值的确定

从表1可看出，溴麝香草酚蓝显色剂pH7.0时，样品的吸光度最大，表明pH7.0时显色剂解离成的阴离子与玛咖生物碱阳离子定量地结合成有色离子对。

表1 不同pH值显色剂对吸光度的影响Table 1 Effect of pH in dye on absorbance

2.1.3 溴麝香草酚蓝显色剂用量的确定

表2 显色剂不同用量对吸光度的影响Table 2 Effect of color reagent in dye on absorbance

表2显示显色剂用量为5.0mL时，样品的吸光度最大，用量增加吸光度没有继续上升，表明5.0mL显色剂形成的阴离子足够与样品的生物碱阳离子定量地结合成有色离子对，使样品充分显色。

根据以上实验结果，确定酸性染料比色法的测定条件：检测波长414nm，溴麝香草酚蓝显色剂pH7.0，显色剂用量为5.0mL。

2.2 线性范围

标准曲线制作结果，得到回归方程为A=11.229C-0.0049，线性关系R2=0.9951，苦参碱在0.01～0.06mg/mL质量浓度范围内线性关系良好。

2.3 玛咖总生物碱含量比色法与滴定法测定结果的比较

采用酸性染料比色法和酸碱滴定法分别对3种颜色玛咖的总生物碱含量进行测定，结果见表3。

表3 3种颜色玛咖总生物碱含量测定结果Table 3 Contents of total alkaloids in 3 color types of Maca

从表3可以看出，酸性染料比色法测定结果3种颜色玛咖的总生物碱含量为2.2241～4.4078mg/g，而滴定法测定结果为5.8025～6.6401mg/g，两种方法的测定结果差异较大，依据不同品种滴定法测定结果是比色法的1.43～2.98倍。滴定法是基于生物碱的碱性与酸反应，根据酸消耗量计算含量，而碱性的强弱与氮原子的杂化度、诱导效应、共轭效应、空间效应及分子内氢键形成等有关。比色法是生物碱在缓冲溶液中结合成的阳离子与酸性染料解离成的阴离子定量结合为有色离子对而显色[10]，结果差异就是由于这两种方法的反应原理不同而导致的。比色法的RSD为0.75%～1.92%，而滴定法的RSD为1.81%～5.68%，滴定法的RSD明显高于比色法，而且已超出允许的范围[14]。滴定法中滴定终点是溶液由橘红色变为黄色，玛咖生物碱的滴定终点突变不是很明显，重现性不好，滴定液误差很难避免，而滴定液很微小的误差都会造成计算结果的很大差异。从实验结果可知，滴定法所需的原料量较大，测定结果误差大。而比色法误差小，所需原料量较小，对总生物碱含量较低的原料也有较高的灵敏度。通过对比色法和滴定法结果的比较，认为对于玛咖总生物碱含量的测定，酸性染料比色法是较理想的方法。

2.4 不同颜色玛咖总生物碱含量的比较

比色法测定结果显示(表3)，3种颜色的玛咖中，紫色玛咖的总生物碱含量最高，达到4.408mg/g，其次是白色样品，黄色样品的总生物碱含量较低，通过方差分析显著性检验，3个样品总生物碱含量的差异已达到极显著水平(P＜0.01)。滴定法测定结果显示(表3)，黄色玛咖的总生物碱含量最高，白色最低，白色玛咖与紫色、黄色玛咖总生物碱含量的差异达到极显著水平(P＜0.01)，而紫色与黄色之间的总生物碱含量在此水平上差异没有达到显著水平。滴定法中紫色样品与白色样品测定结果的相对标准偏差(RSD)较大，表明这两种原料总生物碱含量的测定结果有很大误差，不能准确反映样品的真实含量，因此样品含量的差异与比色法结果不一致。以比色法测定结果为依据，表明云南栽培的紫色、黄色和白色3种玛咖中的总生物碱含量具有极显著的差异，其中紫色玛咖的总生物碱含量最高，为4.4078mg/g。

3 结论与讨论

通过对玛咖总生物碱含量比色法与滴定法测定结果的比较，确定酸性染料比色法是测定玛咖总生物碱含量较理想的方法；通过对酸性染料比色法测定的条件考察，确定了比色测定的方法与条件：测定波长为414nm，溴麝香草酚蓝显色剂的pH7.0，用量为5.0mL。比色法和酸碱滴定法是测定总生物碱含量的常用方法，而对于不同原料，应根据测定结果的准确性、误差、灵敏度等因素来选择较为适宜的方法。在附子总生物碱含量的测定中，何军等[15]通过对两种方法测定结果的比较，认为滴定法操作简单，稳定性较好，较为适宜。张超等[16]采用两种方法测定了山豆根中总生物碱含量，试验结果表明两种方法各有优点，均可用于总生物碱的测定。酸性染料比色法因重复性好、灵敏度高、准确可靠，在许多原料的生物碱含量检测中被广泛应用[17-19]。本实验通过对两种方法测定结果的比较，发现采用滴定法测定玛咖总生物碱时，滴定终点不明显，重现性较差，结果误差较大，笔者认为这与玛咖总生物碱含量不高、滴定法灵敏度较低等因素有关，因此玛咖总生物碱含量测定宜采用灵敏度较高的比色法。

从比色法的测定结果可看出3种颜色玛咖的总生物碱含量的差异达到了极显著水平(P＜0.01)，其中紫色玛咖的总生物碱含量最大，是另外两种样品的1.51～1.98倍。金文闻[20]对玛咖干粉(秘鲁生产，颜色品种不详)的总生物碱进行测定，比色法测定含量为0.4316%，本实验测定的云南栽培的紫色玛咖的总生物碱含量与此相近。

目前还没看到对不同颜色玛咖的次生代谢物质，特别是对不同颜色玛咖的生物碱含量进行分析研究的文献报道，但对不同颜色玛咖的生物功能的比较已有研究。Gonzales等[21-22]和Rubio等[23]用不同颜色的玛咖对抑制大鼠前列腺增生、促进大鼠精子发生、提高切除卵巢小鼠的认知能力和抗压能力等生物功能进行了研究，结果表明不同颜色玛咖的生物活性有明显的差异。云南种植玛咖的体外抗氧化活性分析表明，对于不同的抗氧化体系，3种颜色玛咖抗氧化能力存在一定差别[9]。这些研究表明不同颜色玛咖的生物功能存在明显差异，由此可推测不同颜色玛咖的生物活性物质含量也一定有较大差别，本实验对不同颜色玛咖总生物碱的测定结果也进一步说明了此推测。关于生物碱与玛咖生物活性功能的关系以及活性功能差异与生物碱等次生代谢物质的含量是否有关还有待进一步深入的研究。

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Total Alkaloids in Maca (Lepidium meyenii) Cultivated in Yunnan

GAN Jin，FENG Ying*，HE Zhao，XU Long-feng，ZHANG Hong，CHEN Xiao-ming
(Research Institute of Resources Insect, Chinese Academy of Forestry, Kunming 650224, China)

In this syudy, a determination method was established to analyze the contents of total alkaloids in Maca (Lepidium meyenii) cultivated in Yunnan with 3 kinds of different color. Total alkaloids in 3 color types of Maca were analyzed by acidic dye colorimetry and titration, respectively. Results indicated that acidic dye colorimetry was sensitive with less relative standard deviation (RSD). This method is more appropriate for the determination of total alkaloids in Maca cultivated in Yunnan; The contents of total alkaloids in purple Maca, white Maca and yellow Maca cultivated in Yunnan were 4.4078, 2.9193 and 2.2241 mg/g, respectively, with a significant difference (P＜ 0.01). The content of total alkaloids in purple Maca is the highest, which is close to the content of total alkaloids in Maca grown in Peru.

Maca (Lepidium meyenii)；color type；total alkaloids；content analysis

Q946.88；TS218

A

1002-6630(2010)24-0415-05

2010-09-21

国家林业公益性行业科研专项(201004028)；国家林业局“948”项目(2008-4-13)

甘瑾(1967—)，女，副研究员，博士研究生，研究方向为天然产物活性物质。E-mail：ganjin638@126.com

*通信作者：冯颖(1960—)，女，研究员，博士，研究方向为药用昆虫和天然产物。E-mail：yingf@hotmail.com