响应曲面法优化红葡萄酒中主要芳香物质的SPME-GC分析方法

2010-03-24王宏镭霍江莲李景明葛毅强

食品科学 2010年24期

于静，王宏镭，霍江莲，李景明，葛毅强*

(1.北京市产品质量监督检验所，北京 100071；2.北京市食品研究所茶叶质量监督检验站，北京 100162；3.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；4.科技部中国农村技术开发中心农业处，北京 100045)

于静1，王宏镭1，霍江莲2，李景明3，葛毅强4,*

利用固相微萃取和气相色谱技术对赤霞珠干红葡萄酒中的主要香气成分进行分析，采用单因素和响应曲面法进行试验设计，以香气值为研究指标，研究SPME的萃取时间、萃取温度和电解质(NaCl)的添加量等因素对红葡萄酒中主要芳香物质的影响。结果表明：最佳分析参数是时间30.50min、温度45℃、加盐量0.29g/mL，并对结果进行验证，在此条件下，香气值之和提高了6.1。

葡萄酒；芳香物质；固相微萃取；气相色谱法；香气值；响应曲面法

香气是评判葡萄酒品质的一个重要的感官指标。葡萄酒芳香物质的种类、含量、感觉阈值及其之间的相互作用决定着葡萄酒的感官质量，是构成葡萄酒质量的主要因素，决定着葡萄酒的风味和典型性[1]。判断一种香气物质在体系中作用的大小，一般用香气值(odor activity value，OAV)来表示，它是香气物质的浓度与其阈值的比值。香气值越大，说明该香气物质对葡萄酒整体香气的贡献率越大[2]。因此，利用香气值可以更客观、更完整地评价葡萄酒的香气物质。

目前葡萄酒中芳香物质的提取主要采用液液萃取[3]和固相微萃取技术，其中固相微萃取(solid phase microextraction，SPME)是近年来出现的一种全新概念的样品预处理、浓缩技术，它克服了传统提取方法的诸多缺陷，具有简便、灵敏度高、线性及重现性好、样品处理时间短、分析样品量少、无需有机溶剂绿色环保等优点[2,4-5]。从热力学和动力学分析可知，固相微萃取吸附效率的影响因素主要包括萃取温度、萃取时间和加盐量[4-5]。

本实验将红葡萄酒中具有代表性的14种主要芳香物质(乙酸乙酯、丙醇、2-甲基丙醇、3-甲基丁醇、己醇、乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、己酸、苯乙醇、辛酸、癸酸、2-甲基丁酸、丁二酸二乙酯)的香气值之和作为一个评价指标，阈值参照已有的报道[2,6-7]，采用响应曲面法对萃取时间、萃取温度和加盐量3个因素进行优化。目的是缩短提取时间、提高萃取效果，旨在为SPME萃取其他香气的研究提供参考，为葡萄酒产品质量控制及评定提供技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

赤霞珠(Cabernet Sauvignon)干红葡萄酒(2003年)：乙醇含量为12%(V/V) 北京龙徽葡萄酒有限公司。

氯化钠(分析纯)；4-甲基-1-戊醇(98%) 美国Aldrich公司。

HS-SPME取样装置、聚丙烯酸酯(polyacrylate，PA)萃取头美国Surpelco公司； HP6890气相色谱仪Agilent公司；DB-WAX色谱柱(30m×0.25mm，0.25μm)美国J&W公司。

1.2 方法

1.2.1SPME的萃取

根据文献报道[8-10]，选取萃取效果较好的PA萃取头分析红葡萄酒中的挥发物质。

葡萄酒香气成分的萃取：在15mL装有磁力搅拌器的顶空瓶中加入10mL葡萄酒，分别在不同的萃取温度、萃取时间和加盐量条件下吸附，GC进样口解吸温度260℃，解吸时间10min，进行GC分析。

1.2.2 气谱条件

SPME无分流进样；程序升温：40℃保持5min，以5℃/min的升温速度升至230℃，保持10min；载气N2，流流1mL/min。检测器温度260℃，进样口温度270℃。

1.2.3 定性、定量方法

根据外标法进行定性分析，见图1。利用内标法(4-甲基-1-戊醇)进行定量。

图1 红葡萄酒主要芳香成分标准样品的气相色谱图Fig.1 GC-Chromatogram of standard sample of representative aromatic components in Cabernet Sauvignon red wine

1.2.4SPME萃取效果单因素试验

热力学和动力学分析可知，固相微萃取吸附效率的影响因素主要包括萃取温度、萃取时间和加盐量。根据气谱谱图分析，结合已有的报道[1,6]。赤霞珠干红葡萄酒的主香成分主要有乙酸乙酯、丙醇、2-甲基丙醇、3-甲基丁醇、己醇、乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、己酸、苯乙醇、辛酸、癸酸、2-甲基丁酸、丁二酸二乙酯，所以这14种化合物是红葡萄酒中主要香气成分研究的指标，分别对这3个影响因子作单因素试验(表1)。

表1 单因素试验设计Table 1 Factors of single-factor experiments

1.2.5SPME萃取效果的参数优化试验

采用三因素二次正交旋转组合试验设计，在单因素试验中，已确定SPME参数基础上对其进行进一步的优化。

预试验表明，萃取时间、萃取温度和NaCl加入量是影响主要芳香物质香气值之和的关键因素。因此分别以X1、X2、X3来表示上述关键因子(自变量)，1、0、-1代表其高、中、低水平，按方程Xi＝(xi-x0)/Δx对自变量进行编码。其Xi为自变量的编码值，xi为自变量的真实值，x0为试验中心点时自变量的真实值，Δx为自变量的变化间距。二次旋转回归因素水平编码设计见表2。

表2 正交旋转组合试验因素水平及编码Table 2 Factors, levels and codes of orthogonal rotation composite experiments

葡萄酒中主要芳香物质香气值之和Y为评价指标，即响应值。对应Y的预测模型由最小二乘法拟合的二次多项方程为：

式中：Y为响应值；A0为常数；A1、A2、A3为线性影响系数；A11、A22、A33为平方效应影响系数；A12、A23、A13为交互作用系数。为了求得此方程的各项系数，需15组试验来求解。模型的准确性通过多元回归系数R2检验，各系数的显著性进行t检验和P检验。统计软件采用美国Statsoft公司STATISTICA 6.0和SAS 8.0，设计及结果见表3。

表3 三因素二次正交旋转回归组合设计与结果Table 3 Design and results of orthogonal rotation composite experiments

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 萃取时间的确定

顶空固相微萃取是一种在平衡状态测定的被分析物的方法，分析物的平衡状态由分析物在系统三相中的物质分配决定。这三相包括薄膜、顶空和溶液。一旦分析物在三相中达到平衡，它们每一相的质量浓度为一常数。所以要准确测定分析物在薄膜中的质量浓度，首先要使系统达到平衡状态，该平衡状态可通过被分析物的萃取时间与峰面积测定，峰面积为常数时的时间为平衡时间，而且通过严格控制萃取时间保持一致，即可获得良好重现性的结果。本实验选用PA萃取头，固定其他萃取条件，在NaCl 0.2g/mL加入量、吸附温度40℃的条件下，分析萃取时间对萃取效果的影响。

结果(表4)显示，在14种主要芳香成分中有6种是在30min达到吸附最大值，他们是乙酸乙酯、己醇、癸酸乙酯、2-甲基丁酸、辛酸和癸酸；有5种物质在40min达到最高点，分别是丙醇、3-甲基丁醇、辛酸乙酯、丁二酸二乙酯和苯乙醇；在50min时有两种物质达到最高点，分别是2-甲基丙醇和己酸；而乳酸乙酯在60min时才达到最大值；在萃取20min没有香气物质达到吸附浓度最大值。大部分香气物质的变化趋势是先升高后降低，跟理论解释一致。总体香气值在萃取30min达到最高值，所以得到在时间单因素试验中，萃取30min为最佳。14种芳香物质阈值见表4[11-12]。

2.1.2 萃取温度的确定

萃取温度对SPME法的影响具有双重效应：升高温度有利于香气物质在葡萄酒中的扩散(提高了香气成分的顶空分配)，缩短平衡时间、加快分析速度；但是升高温度使香气成分在涂层(PA)与葡萄酒中的分配系数降低，萃取头对香气成分的吸附量较少，影响SPME的灵敏度。所以应该选择最佳温度。同样在固定NaCl加入量、吸附时间的条件下，分析萃取温度对萃取效果的影响。

表4 不同萃取时间下红葡萄酒中主要芳香物质的香气值(OAV)Table 4 Aroma values of major aromatic components in Cabernet Sauvignon red wine under different extraction time

表5 不同萃取温度下红葡萄酒中主要芳香物质的香气值Table 5 Aroma values of major aromatic components in Cabernet Sauvignon red wine under different extraction temperatures

表6 不同NaCl加入量对下红葡萄酒中主要芳香物质的香气值Table 6 Aroma values of major aromatic components in Cabernet Sauvignon red wine under different concentrations of NaCl

从表5可以看出，随着温度的升高可，大部分香气的萃取效率变高，当达到一定温度后，又呈下降趋势。在30℃时有4种物质达到吸附最大值，分别是乙酸乙酯、己醇、乳酸乙酯和辛酸乙酯；在40℃时有6种香气物质达到吸附最大值，它们是丙醇、2-甲基丙醇、癸酸乙酯、2-甲基丁酸、己酸和癸酸；在50℃时，二酸二乙酯和苯乙醇两种物质达到吸附最大值；在60℃时3-甲基丁醇、辛酸达到最大值。总体香气值在40℃和50℃萃取条件下，差异不大，但是考虑到单个香气物质和气谱图的峰形，在温度的单因素试验中选40℃为萃取温度。

2.1.3 样品基质质量浓度的确定

减少被分析物在水溶液的可溶性，能使更多的挥发性物质挥发至溶液的顶空，吸附到纤维头，从而降低该方法的检测限，提高香气物质的响应值，在溶液中加入强电解质无机盐NaCl，溶液的粒子强度增加，使有机分析物的非极性相对增强并使其在水溶液中的溶解度下降，萃取量得到增加。同时盐的加入还会影响基质黏度，降低分析物的扩散速度，产生盐的负效应，所以应该对NaCl的量进行优化。在PA萃取头，吸附温度40℃，吸附时间30min的条件下，分析NaCl对萃取效果的影响。

从表6可以看出，在不加NaCl的空白实验中，只有丁二酸二乙酯达到吸附最大值，说明电解质对其的萃取效果影响不大；当质量浓度是0.1g/mL时，没有物质达到吸附最大值；0.2g/mL时，有4种物质达到吸附最大，分别是乙酸乙酯、丙醇、2-甲基丙醇和己酸；在0.3g/mL质量浓度时，有9种物质达到吸附最大值，分别是3-甲基丁醇、己醇、乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、2-甲基丁酸、苯乙醇、辛酸和癸酸；在4g/mL质量浓度时，没有芳香物质达到吸附最高值。总体香气值在0.3g/mL的质量浓度时，效果比较好。所以在加盐量单因素试验中选0.3g/mL为最佳加盐质量浓度。

2.2SPME实验条件优化

2.2.1 模型建立及显著性检验

干红葡萄酒中主要芳香物质的香气值之和见表3。

利用SAS软件对表3中的数据进行多元回归拟合，获得主要芳香物质香气值之和(Y)对自变量萃取时间(X1)、萃取温度(X2)和NaCl加入量(X3)的二次多项回归模型方程为：

对该模型进行方差分析，结果见表7，模型系数显著性检验见表8。

表7 回归模型方差分析表Table 7 Variance analysis of regression equation

表8 回归方程系数显著性检验表Table 8 Significance test for regression coefficients

由表6方差分析可以看出，FOAV=33.02＞F0.05(9,2)= 19.40，P＜0.05，说明模型方程(2)显著，不同处理间的差异显著；FSN＝2.24＜F0.05(9,3)＝8.81，失拟项P＝0.32＞0.05，不显著；模型的校正决定系数R2Adj=90.95%，说明该模型能解释约90.95%响应值的变化，仅有总变异9.05%不能用次模型解释，相关系数R为98.35%，说明该模型拟合程度良好，试验误差下，该模型是合适的，可以用此模型来分析和欲测SPME提取红葡萄酒主要芳香物质的最优条件。从表7回归方程系数显著性检验可知：模型(2)一次项X1(P＜0.05)、X3(P＜0.05)显著；二次项X12(0.0058)、X32(0.0001)显著；交互项不显著。

2.2.2SPME萃取效果(葡萄酒中主要芳香物质香气值总和)的响应曲面分析及优化

由上述结果得出，萃取时间和NaCl加入量是对SPME萃取效果影响最大的因素，其中以NaCl加入量尤为重要。从图2可以看出，随着萃取时间的延长，NaCl加入量的增加，萃取效果也显著增大，当萃取时间和NaCl质量浓度分别在28.75～33.25min和0.285～0.308 g/mL的范围内时，萃取效果达到最大。萃取时间和NaCl加入量超出这个范围后，萃取效果降低，这与理论相一致。因为萃取温度影响不显著，分析各个温度段的谱图，综合考虑试验过程中的各种因素，最后确定的萃取温度45℃、萃取时间30.50min、NaCl加入量0.29g/mL。

图2 SPME萃取过程中主要香气物质的香气值之和与个两因素的函数关系图和等高线图Fig.2 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction among two factors on total aroma value of major aromatic components during SPME process

2.2.3SPME优化试验的验证

根据响应曲面分析得出的优化条件进行验证实验，结果得到5次重复实验的香气值范围为175.6～185.3，均值为180.1，比试验最高值提高了6.1，这表明在SPME提取条件优化试验中，响应面法是可靠的方法。

3 结论

本实验结合主要芳香物质香气值之和评价结果，通过响应曲面法进行优化，确定最后的优化条件是萃取时间30.50min、萃取温度45℃、NaCl加入量0.29g/mL。在此优化条件下，得到了较好的试验结果，模型具有应用价值。

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SPME-GC Analysis of Aromatic Components in Red Wine by Response Surface Methodology

YU Jing1，WANG Hong-lei1，HUO Jiang-lian2，LI Jing-ming3，GE Yi-qiang4,*
(1. Beijing Products Quality Supervision and Inspection Institute, Beijing 100071, China；2. Station of Tea Quality Supervision and Examination, Beijing Food Research Institute, Beijing 100162, China；3. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China；4. China Rural Technology Development Center, Ministry of Science and Technology, Beijing 100045, China)

Major aromatic components in red wine were analyzed by solid-phase micro-extraction and gas chromatography (SPME-GC). Effects of extraction time, extraction temperature and NaCl concentration on major aromatic components in red wine were explored by single-factor and response surface experiments. Results indicated that the optimal parameters of SPMEGC analysis were extraction time of 30.50 min, extraction temperature of 45 ℃ and NaCl concentration of 0.29 g/mL. Under the optimal conditions, total aroma value was increased by 6.1 folds.

red wine；aromatic components；solid phase micro-extraction(SPME)；gas chromatography(GC)；aroma value；response surface design

TS262.6

1002-6630(2010)24-0389-06

2010-04-12

于静(1980—)，女，工程师，硕士，研究方向为食品分析与检测。E-mail：happyyujing@126.com

*通信作者：葛毅强(1971—)，男，副教授，博士，研究方向为食品科学与工程及其科技管理。E-mail：gyq@crtdc.org.cn