固相美拉德反应增香法制备虾风味料工艺及SPME-GC-MS测定

解万翠，杨锡洪*，陈昊林，章超桦，吉宏武

(水产品深加工广东省普通高校重点实验室，广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524088)

固相美拉德反应增香法制备虾风味料工艺及SPME-GC-MS测定

解万翠，杨锡洪*，陈昊林，章超桦，吉宏武

(水产品深加工广东省普通高校重点实验室，广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524088)

为提高对虾副产品深加工利用水平，以南美白对虾虾头酶解蛋白粉为原料，采用微波加热实验设备，以感官品评为指标，研究影响低水分含量的固相原料美拉德反应增香效果的各因素，并通过单因素试验以及响应面法优化最佳条件。结果表明：将虾头酶解液pH值调整为6.9，进行干燥处理，制备虾头酶解蛋白粉；添加增香剂，其中还原糖5%、氨基酸2%、牛磺酸0.3%；通过响应面优化的微波加热最佳工艺条件：反应时间2min、起始水分含量30%，得到的虾风味料虾味浓郁；产品经SPME-GC-MS检测，共鉴定出69种风味成分，主要有吡嗪类、酮类、醇类、醛类、嘧啶和有机酸等化合物。其中吡嗪类物质占挥发性成分相对含量49.86%，在产品香气中起主导作用。本实验所得最佳工艺不但可以提高对虾副产品的深加工利用，同时为复合调味料的生产开拓了新的领域。

虾头酶解物；微波加热；美拉德反应；风味基料；固相微萃取；气相色谱-质谱联用

虾头是对虾加工的副产品，占虾体质量的30%～40%[1]，目前对于虾头的综合利用主要有提取虾青素、甲壳素、壳聚糖，生产饲料以及制备蛋白水解物等。虾头蛋白水解后产生丰富的氨基酸、肽及可溶性蛋白，具有增加营养价值、提高功能特性以及具有潜在的生物活性等特点，因此利用虾副产品制备水解蛋白已经在食品工业中得到广泛应用。

由于虾头中还含有脑磷脂、卵磷脂、类胡萝卜素、碳水化合物、维生素等营养成分，钙、磷、铁、锌等微量元素以及牛磺酸、生理活性肽、核苷酸等活性成分[2]，因此，利用低值虾头生产高质量天然海鲜调味品可极大提高产品的附加值。依据近年来调味品行业倡导的“味料同源”理念，以含有丰富的氨基酸，多肽等呈味物质及具有浓郁海鲜风味的水产下脚料制备风味基料并进行复配，生产新型海鲜复合调味品日渐受到消费者的喜爱并引起调味品行业的关注。

以往研究[3-6]主要集中在水相美拉德反应法生产虾风味基料工艺的探索，即采用虾头酶解物，置于反应釜中进行热反应，此法生产的调味基料生产成本较高，且产品为液体，且在后期的干燥中风味成分损失严重。本实验先制备虾头酶解蛋白粉末，然后对酶解蛋白粉进行固相增香加工处理。以期在低水分含量的条件下运用新型加工工艺得到风味更优的新型虾风味基料，并通过感官品评和GC-MS结合的方法描述和分析固相增香产物的风味。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

虾头：南美白对虾(又名凡纳滨对虾)虾头，由广东省湛江市亚洲水产有限公司提供。

葡萄糖、木糖、甘氨酸、精氨酸、牛磺酸(均为分析纯) 天津市百世化工有限公司；风味酶(8万U/g)、中性蛋白酶(12万U/g) 南宁庞博生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

WG900型微波炉 格兰仕日用电器有限公司；气相色谱-质谱联用仪 美国Finnigan公司；固相微萃取装置(SPME)(PDMS 100μm) 美国Supelco公司。

1.3 仪器条件

1.3.1 色谱条件

PEG 20M色谱柱(30m×0.25mm，0.25μm)；程序升温，40℃保持2min，以6℃/min速度升至120℃，再以10℃/min升至250℃保持10min；载气(He)流速0.8mL/ min，压力2.4kPa，进样量0.5μL；不分流进样。

1.3.2 质谱条件

电子轰击(EI)离子源；电子能量70eV；传输线温度250℃；离子源温度200℃；质量扫描范围m/z 33～450，检测器电压350V。

1.4 虾头酶解蛋白粉制备

虾头清洗干净，用打浆机破碎，得到虾头泥。对虾头泥进行预热变性处理，在85℃恒温水浴中保持搅拌10min。在虾头泥中按0.25g/100g添加量加入风味酶，按0.05g/100g加入中性蛋白酶，调节pH7，54℃水浴2h后85℃水浴灭酶10min，再调节体系pH值为7，制备出酶解虾头浆。酶解虾头浆经过压榨、过滤，转移至喷雾干燥设备中进行喷雾干燥，得到虾头酶解蛋白粉。

1.5 微波加热固相增香工艺优化

1.5.1 单因素试验

按照木糖:葡萄糖为1:4配制还原糖，甘氨酸:精氨酸为1:1配制氨基酸，然后研究还原糖添加量、氨基酸添加量、还原糖与氨基酸添加量比例、牛磺酸添加量、加热时间、水分含量、起始pH值等因素的影响，并对反应产物进行感官品评[5]。

1.5.2 响应面设计优化

基于单因素试验结果，选择加热时间、初始水分含量、pH值三因素五水平的工艺参数进行中心组合试验设计，反应产物用评分检验法进行感官评定，最后以感官评定所得的分数作为试验指标。中心组合试验因素见表1。

表1 中心组合试验因素水平Table 1 Factors and levels of central composite experiments

1.6 感官品评

邀请十名熟悉虾风味的专业人员，首先对感官品评方法进行解释和培训，取经过沸水灼煮的虾头10～20个，捣碎后置于广口容器中，让感官品评员充分熟悉煮熟对虾的香气，做为纯正熟虾风味的参比，并对固相增香产品进行感官品评和评分。

品评时，将样品用蒸馏水按1:50稀释至同一浓度，随机编号。设定甜味、苦味、咸味、鲜味、煮虾香味、焦香味6个指标进行感官评定，把评价的强度结果用等距标度计分，以十分制转化为数值。该感官评定所得数值作为实验产品的感官指标。最后的评分结果取各项指标的的平均分乘以权重，再加和得出最终评分。感官评定标准及权重设置见表2。

表2 虾风味的感官品评权重(HW)及评分标准Table 2 Heavy weights (HW) and standards of sensory evaluation for shrimp flavor

1.7 SPME-GC-MS对挥发性风味成分的检测

萃取条件：萃取头PDMS、厚度100μm、萃取温度50℃、萃取时间30min。具体操作参照文献[7]进行。

2 结果与分析

2.1 微波加热固相美拉德反应单因素试验

图1 单因素试验结果Fig.1 Results of single factor experiments

在微波作用下体系产生的热效应可认为等同于常规加热方法[8]。分析单因素试验结果(图1)，发现随着还原糖添加量的增加，微波加热固相增香的效果逐渐增强，添加量达到5%时，增香效果较好，产品虾味明显，并伴有适宜的烧烤香味。当添加量大于5%后，焦香味逐渐覆盖虾的鲜香味，但这种影响不明显。随着氨基酸添加量的增加，微波加热增香的效果也相应地提高，当添加量到达6%时，增香效果最佳，海鲜风味浓郁，表明还原糖和氨基酸是美拉德反应生香的重要前体物质，但当氨基酸的添加量达到8%时，香气中带有轻微刺激性的挥发性氮气味，添加量达到10%时，这种刺激性气味更加浓烈，说明较多的氨基酸不能完全与还原糖发生羰胺反应，而是在加热过程发生了降解。在还原糖与氨基酸总量为7%条件下，调整其比例，当相对比例在5:2时风味最佳，具有柔和醇厚的烤虾香味和肉味。文献资料关于美拉德反应动力学研究[9]显示，葡萄糖与甘氨酸在不同的比例下发生美拉德反应生成产物有所不同，是由于该比例对分子重排反应的化学平衡有一定程度的影响作用。

本实验添加牛磺酸进行反应，在0.3%添加量时获得较好的香气，但添加量大于0.4%后，产生了类似铁腥味的不良风味。国外已有研究报道牛磺酸是在热反应当中产生海鲜独有鲜香味的重要氨基酸，当温度高于100℃条件下，在甘氨酸存在的食品体系中，微量的牛磺酸可抑制酰胺物质的形成和降低褐变程度[10]，但对于牛磺酸的增香机理尚未有报道。

林业技术管理的关键不仅在于管理者对林业技术管理的专业知识，而且在于林业生产企业对管理知识的提升。有些企业没有意识到管理知识的重要性，因此没有在企业内部大力推广管理知识。然而，推广是不够的。一方面，林业员工无法意识到森林管理技术的重要性，另一方面，他们无法丰富员工和管理人员的森林管理技术知识。认识到问题不能很快解决。这会给企业带来损失，但也可能引起内部矛盾。

研究表明，美拉德反应的进行必须在食品中的水分大于等于10%，通常为15%以上。且在一定范围内(10%～25%)，随着水分含量的增加，分子扩散容易，美拉德反应速度也加快[11]。本实验中随着水分含量的增加，固相增香产品香气的评分上升，当水分含量在30%时，香味评分最高，呈浓郁柔和的烤虾香气。当水分含量超过30%后，评分开始下降。

Maillard反应体系的初始pH值对挥发性物质的产生起着重要的影响作用。随着反应体系起始pH值的升高，微波加热Maillard反应增香效果越来越好，当起始pH值达到7时，增香作用最明显，香气柔和，虾味和焦香味恰到好处，但超过pH7以后，Maillard反应产物风味急剧下降，尤其当pH值到达pH9时，挥发气味带有刺激性的不良风味，而且产物的颜色较黑。已有研究表明[12]，初始体系的pH值增加，羰胺反应产生的吡嗪类物质的种类和数量也增加，吡嗪是具有较强风味和气味的一大类物质，对优化食品风味起着重要作用。体系pH值对吡嗪类物质的产生有着决定性作用，因为羰基和氨基随着体系氢离子浓度的变化进行不同程度的离子化，而这些基团的离子化对吡嗪物质生成的第一步是非常关键的。在酸性介质下热反应的效果欠佳，这可能由于在酸性较强的介质中，氨基的反转使美拉德反应的中间产物变得不活泼，从而得不到大量的芳香类物质。在碱性介质中，氨基酸呈阴离子态，此时氨基酸的反应性加强，羰氨缩合后，糖通过反醇醛、烯醇化和脱水反应进行降解。这些反应都具有碱催化作用，所以美拉德反应速率随介质的pH值升高而增大。美拉德反应速度过快，会导致产生不良香气的反应提前进行，呈现反应过度的状态。同时由于焦糖化反应也加快，在低水分含量下温度容易接近焦糖化反应而产生很多不愉快的风味。因此，pH值过高或者过低，都不利于风味物质的形成。

2.2 微波加热固相美拉德反应条件优化

根据感官品评标准评分，三因素五水平中心组合试验结果见表3。

2.2.1 二次回归模型拟合

根据表3的结果，以感官评分结果为响应值，运用design_expert 7.1.6(Response surface)程序，确定了回归方程的系数，该试验的回归方程为：

表3 中心组合试验感官品评结果Table 3 Sensory evaluation results of central composite experiments

2.2.2 数据分析

表4 方差分析Table 4 Variance analysis of central composite experiments

从表4可以看出，加热时间(X1)、pH值(X3)对响应变量反应产物风味评分的影响显著，水分含量(X2)对响应变量反应产物风味评分的影响不显著，其原因可能在于水分含量水平之间的差异不大，反应体系中分子的活动自由程度差异也不大所致。

表5 各项误差分析Table 5 Error analysis of each factor

响应变量的二次多项式模型的回归系数如表5所示，各项系数经t检验得加热时间(X1)二次项和pH值(X3)二次项对反应产物的风味评分影响显著；各因素之间的交叉项系数除加热时间和pH值交叉项对风味评分为显著以外，其他交互因素对风味评分的影响不显著，说明各因素之间交互作用不明显。

根据F值的大小以及对各回归系数的分析，可以判定各试验因素对响应值的的影响依次是：X1＞X3＞X2。即对响应变量反应产物风味评分的影响重要程度依次：加热时间＞体系初始pH值＞水分含量。

2.2.3 回归模型的响应面分析

图2 微波加热下固相增香反应的响应曲面图和等高线图Fig.2 Response surface and contour plots for microwave-heating Maillard reaction

由图2可知，随着加热时间的延长，感官品评综合分值随之增加，而随着时间的继续延长，感官品评综合分值则缓慢降低，曲线较平缓；当水分含量较低时，感官品评综合分值也较低，随着水分含量的增加，感官品评综合分值逐渐增加，但到达一定值后，再增加水分含量，感官品评综合分值则缓慢降低。pH值对感官品评综合分值的影响趋势同加热时间，随着pH值的逐渐增加，感官品评综合分值也逐渐增加，直到最佳pH值时，感官品评综合分值最大，随后，随着pH值的增加，感官品评综合分值则逐渐降低。感官品评综合分值随着水分含量的逐渐增加而缓慢增加，到达最大值后，即使水分含量继续增加，感官品评综合分值增加的很少。

对等高线的综合分析可以看出，加热时间是影响感官品评综合分值的最显著因素，表现为等高线较陡峭；体系初始pH值次之；水分含量对其影响最小，表现为等高曲线较为平滑。

2.2.4 固相增香最佳反应参数的求解

稳定点的分析可用数学方法来求解。如果一个函数的稳定点存在，它应该使其对每一个决定变量的偏导数分别为零，这样可以联立一个方程组，求出该稳定点。

为了确定最佳点的值，对回归方程取一阶偏导等于零，去掉不显著项，整理得方程组如下：

解方程组得，X1=0.2268、X2=-0.0054、X3=-0.1155。

利用此方法求出数学模型的稳定点坐标为(0.2268，-0.0054，-0.1155)，稳定点的坐标也即变换为(2.112，30%，6.885)，此时模型达到最大值，最大值为7.1分。也就是说适宜的加热时间为2.1min，水分含量30%，pH6.9。该参数经验证实验所得分数为7.3分，与模型理论最大值相近。

2.3GC-MS测定结果

图3 微波加热固相增香产品的挥发性成分总离子流色谱图Fig.3 Total ion current chromatogram of volatile components in microwave-heating Maillard reaction products

通过SPME-GC-MS测定，微波加热固相增香产物挥发性化合物的总离子流图如图3所示，微波加热下的美拉德反应增香制备的虾香味料的GC-MS鉴定结果及含量如表6所示。

由表6可见，虾风味成分主要由吡嗪、酮、醇、醛、嘧啶、有机酸等化合物组成，其中吡嗪类物质的相对含量高达49.86%，并以3-乙基-2,5-二乙基-吡嗪的相对含量最高，达11.86%。说明吡嗪类物质是对虾头酶解蛋白固相增香产品风味贡献最大的物质，据文献报道，吡嗪类物质是熟对虾，煮小龙虾，烤虾的风味成分的主要贡献物质[13]，具有特殊的海鲜肉气味、烤香、果仁[14]的特征香气。其次为醛类物质，相对含量达18.87%，其中以4-辛基-苯甲醛的相对含量最高，达12.87%。醇类物质占8.98%，主要物质为1-(2-丁氧基乙氧基)-乙醇；酮类占7.45%，主要物质为1-羟基-2-丙酮。有机酸使其具有淡甜柔和的气味，酯类则可提高和改善其香味，其他物质如吡咯、呋喃、酯等有机化合物也对风味起着重要的贡献[15]。它们共同构成了产品的风味特征，使产品具有强烈的海鲜特征气味。

表6 微波加热固相增香产物的GC-MS鉴定结果及含量Table 6 Identification and contents of microwave-heating Maillard reaction products by GC-MS

续表6

3 结 论

3.1 通过单因素和响应面试验设计优化确定各因素对产物风味影响的大小顺序：反应时间＞水分含量＞pH值。微波加热Maillard反应的最佳条件：还原糖添加量5%、氨基酸添加量2%、牛磺酸添加量0.3%、反应时间2min、水分含量30%、起始pH6.9。

3.2 微波固相加热增香产品中含有丰富的挥发性化合物，对于其特征性的香气有重要的作用。首先由感官品评得到风味良好的虾调味料，然后经GC-MS检测其挥发性风味成分，分析结果表明吡嗪类物质占挥发性成分相对含量的49.86%，具有烤肉和果仁香气，对于增香产品的香气贡献是最大的。

3.3 通过工艺优化，以虾头酶解蛋白粉为原料，所制备的虾风味基料除保留原有的海鲜风味和特色外，香味更加浓郁，本实验所得最佳工艺不但可以提高对虾副产品的深加工利用，同时为复合调味料的生产开拓了新的领域。

[1]王锭安, 吉宏武. 冷冻即食熟虾仁加工工艺[J]. 食品科技, 2010, 29 (4): 133-135.

[2]李来好, 王道公, 吴燕燕. 虾头的加工利用[J]. 湛江水产学院学报, 1995(1): 102-105.

[3]王岚. 使用虾肉酶解液进行Maillard反应的呈味研究[J]. 江苏调味副食品, 2006, 23(4): 12-13.

[4]张彩菊. 利用美拉德反应制备鱼味香料[J]. 无锡轻工大学学报, 2004, 23(5): 9-10.

[5]解万翠, 杨翰彬, 章超桦, 等. Maillard反应型虾风味料的制备[J]. 食品与机械, 2008, 24(1): 34-44.

[6]祖道海, 宋焕禄, 李大明, 等. Maillard反应制备虾味香精[J]. 食品科学, 2006, 27(9): 147-149.

[7]吴海燕, 解万翠, 杨锡洪, 等. SPME-GC-MS法测定腌制金丝鱼挥发性成分[J]. 食品科学, 2009, 30(18): 278-281.

[8]陈艳云, 胡卓炎, 余小林, 等. 微波加热下美拉德反应条件优化研究[J]. 食品工业科技, 2005, 26(8): 61-64.

[9]MARTINS S I F S, BOEKEL M A J S V. A kinetic model for the glucose/glycine Maillard reaction pathways[J].Food Chemistry, 2005, 90(2): 257-269.

[10]SHIN D C, KIM C T, LEE Y C, et al. Reduction of acrylamide by taurine in aqueous and potato chip model systems[J]. Food Research International, 2010, 43(5): 1356-1360.

[11]MA Jinyu, PENG Xiaofang, CHENG Kawing, et al. Effects of melamine on the Maillard reaction between lactose and phenylalanine[J]. Food Chemistry, 2010: 119(1): 1-6.

[12]孙丽平, 汪东风. pH和加热时间对美拉德反应挥发性产物的影响[J].食品工业科技, 2009, 30(4): 122-124.

[13]刘安军, 魏灵娜, 曹东旭, 等. 美拉德反应制备烧烤型虾味香精及气质联用分析[J]. 现代食品科技, 2009, 25(6): 674-677.

[14]ROCHAT S, EGGER J, CHAINTREAU A. Strategy for the identification of key odorants: application to shrimp aroma[J]. Journal of Chromatography A, 2009, 1216(36): 6424-6432.

[15]孟绍凤. 虾风味的分析和虾风味基料的制备[D]. 无锡: 江南大学, 2006.

Preparation Processing of Shrimp Flavorings by Microwave-heating Maillard Reaction Method and Determination of Volatile Aroma Compounds

XIE Wan-cui，YANG Xi-hong*，CHEN Hao-lin，ZHANG Chao-hua，JI Hong-wu
(Key Laboratory of Aquatic Product Advanced Processing of Guangdong Higher Education Institutes, College of Food Science and Technology, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China)

In order to improve the depth development and utilization of shrimp by-products, the hydrolysate powder of Penaeus vanamei shrimphead was used as raw material to conduct microwave-heating treatments. Based on the single factor experimental results, the optimal preparation processing was explored by response surface experiments using sensory evaluation as the index. Results indicated that the optimal enzymatic hydrolysis processing were enzymatic hydrolysis pH of 6.9, reducing sugar of 5%, amino acids of 2% and taurine of 0.3%. Meanwhile, the optimal microwave-heating processing parameters were reaction time of 2 min and initial water content of 30%. Under these optimal processing conditions, prepared shrimp flavorings exhibited strong aromatic flavor. A total of 69 volatile flavor components were detected in prepared products by SPME-GC-MS, which included pyrazines, ketones, alcohols, aldehydes, and organic acids. Moreover, the pyrazines was accounted for 49.86% of total volatile components and exhibited a significant contribution to product aroma. These investigations not only improve the depth exploitation and utilization of shrimp by-products, but also provide a new area for the development of compound seasonings.

shrimphead hydrolysate；microwave-heating；Maillard reaction；flavorings；SPME-GC-MS

TS254.9

A

1002-6630(2010)24-0199-07

2010-06-30

“十一五”国家科技支撑计划项目(2007BAD29B09；2008BAD94B08)

解万翠(1969—)，女，副教授，博士，研究方向为食品风味和食品质量与安全。E-mail：xiewancui@163.com

*通信作者：杨锡洪(1963—)，男，副教授，博士，研究方向为食品添加剂。E-mail：yangxihong63@163.com