琐琐葡萄果实总黄酮提取工艺

祖丽皮亚·玉努斯

(新疆大学生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830046)

琐琐葡萄果实总黄酮提取工艺

祖丽皮亚·玉努斯

(新疆大学生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830046)

研究琐琐葡萄果实总黄酮的醇法提取工艺。在考察各影响因素的基础上设计正交试验，得出各种因素对提取效果影响的主次顺序为料液比＞提取时间＞提取温度＞乙醇体积分数，总黄酮提取最佳工艺条件为：提取温度80℃、乙醇体积分数60%、提取时间120min、料液比1:30(g/mL)。

琐琐葡萄；总黄酮；提取工艺

琐琐葡萄是葡萄科(Vitaceae)葡萄属(Vitis)植物山葡萄(Vitis vinifera L.)的果实，主产于新疆吐鲁番、鄯善、和田等地。果实含果糖、葡萄糖、苹果酸、柠檬酸、维生素类、氨基酸类及黄酮类等成分[1]。主治气血虚弱、肺虚咳嗽、心悸盗风、湿痹痛、淋病、浮肿。李时珍在《本草纲目拾遗》中详细论述了产自吐鲁番的琐琐葡萄的药用价值，说它大若五味子，形如胡椒，小儿食之，能解痘毒[2]。时至今日，琐琐葡萄仍是维吾尔人用来治疗小儿麻疹的首选良药[3]。

本实验对琐琐葡萄总黄酮提取工艺进行研究，以期获得最佳提取工艺，可为利用琐琐葡萄工业化生产黄酮类药用成分提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

琐琐葡萄(Vitis vinifera L.)，采自中国科学院新疆分院吐鲁番沙漠植物站。

芸香叶苷(芦丁，rutin) 中国医药集团上海化学试剂公司；乙醇、石油醚、甲醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠等试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

RE-52A型旋转蒸发仪、BT-23I型水浴锅 上海亚荣生化仪器厂；LDZX-40BI型高压蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；THZ-82型恒温培养箱 金坛市国旺实验仪器厂；752型分光光度计 上海元析仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的制备[4]

精密称取在120℃恒温干燥至质量恒定的芦丁标准品25mg置于100mL容量瓶中，加70%乙醇50mL置水浴上微热使溶解，放冷，加70%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得所需标准液(0.25mg/mL)。

1.3.2 样品溶液的制备[4]

取琐琐葡萄，置恒温箱中干燥24h，研碎，用石油醚脱脂后在恒温箱里干燥2h。精密称量10g用过滤纸包好置索氏提取仪中按一定的料液比加入乙醇溶液，在80℃下加热回流一定时间，移去回流液，用少量70%乙醇洗涤容器，减压蒸馏回收乙醇，过滤回流液，移至250mL容量瓶。用少量70%乙醇洗涤容器，洗液并入容量瓶中，用70%乙醇定容，摇匀即得样品溶液。

1.3.3 最佳测定波长的选择[5]

取芦丁标准溶液2.0mL置于25mL容量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置10min。加入1%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置10min。加入4%氢氧化钠溶液10mL，加水定溶，摇匀，放置15min。以空白作对照，用752分光光度计在450～550nm间扫描，确定最佳测定波长。

1.3.4 标准曲线绘制

精确吸取标准溶液0.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、0.7mL分别置于25mL容量瓶中，分别加入5%亚硝酸钠溶液1mL摇匀，静置10min，加入1%硝酸铝溶液1mL摇匀，静置10min，加入4%氢氧化钠溶液10mL，70%乙醇定容至刻度静置15min。在500nm波长处测溶液的吸光度，得到芦丁标准溶液的工作曲线，用最小二乘法进行线性回归，得回归方程：C=0.0894A-0.0005，相关系数r=0.9989，表明有良好的线性关系，作为琐琐葡萄中总黄酮含量的测定方法。

1.3.5 稳定性实验[5]

按照1.3.4节标准曲线绘制方法，对标准品和样品溶液放置一定时间后测定吸光度，考察其稳定性。

1.3.6 总黄酮提取工艺单因素试验[6-9]

分别研究提取剂种类、样品脱脂与不脱脂的区别、提取时间、提取剂体积分数、提取温度、料液比等因素对琐琐葡萄果实总黄酮含量的影响。

1.3.7 提取工艺条件的优化[10-12]

为了确定最佳工艺条件，参考有关资料，确定以乙醇体积分数、提取时间、提取温度、料液比4种因素进行正交试验设计及测定。

2 结果与分析

2.1 总黄酮含量的测定结果

2.1.1 最大吸光度的测定

如图1所示，显示芦丁在500nm处吸光度最大，即最佳测定波长为500nm。

图1 芦丁最大吸光度的测定Fig.1 Determination of maximum absorbance wavelength for rutin

表1 稳定性实验结果Table 1 Results of stability experiments

2.1.2 稳定性实验结果

取标准溶液和样品溶液各2.0mL，按1.3.4和1.3.5节方法操作，每隔5min测一次。结果如表1所示。

表1结果显示：标准溶液在配制后的2h内稳定性良好。样品溶液在配制后的1h内稳定性良好。

计算相对标准偏差(RSD)为：标准溶液的RSD0.62%，样品溶液的RSD 2.5%。

2.2 单因素试验

2.2.1 黄酮提取剂的确定

在提取温度80℃、提取时间1h、琐琐葡萄2g、溶剂用量20mL条件下，分别用甲醇、乙醇和水进行提取，以分光光度计测定提取液的吸光度，选择最好的提取溶剂。结果见图2。

图2 不同提取溶剂的浸提效果比较Fig.2 Effect of solvent type on extraction rate of total flavonoids

由图2可知：采用水提取效果最差，原因是一些大分子物质(蛋白质，糖类等)溶出而引入杂质，使得过滤很难。甲醇提取效果好于水，但甲醇有毒性，而乙醇的提取不易引入杂质，产品纯度高，所以选择乙醇作为最佳的提取溶剂。

2.2.2 样品脱脂与不脱脂的区别

在提取温度80℃、提取2次、每次1h、琐琐葡萄量2g、乙醇溶液用量20mL条件下。考察提取前对原料进行脱脂和不脱脂对提取效果的影响。

图3 样品脱脂与不脱脂的区别Fig.3 Effect of degreasing treatment on extraction rate of total flavonoids

图3 结果显示，在相同乙醇体积分数条件下，用石油醚脱脂后的提取效果好于不脱脂的提取效果，这是因为在提取过程中，提取溶剂对脂类物质的溶解，降低了对黄酮类物质的溶解，所以提取前先用石油醚对原料进行脱脂，可以提高总黄酮的得率。

2.2.3 提取时间的影响

图4 提取时间对浸提效果的影响Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of total flavonoids

称取5g琐琐葡萄，用50mL 70%乙醇溶液在室温下浸泡。检查提取时间对黄酮提取效果的影响。图4结果显示，0～120min期间溶液的吸光度增大，120min后吸光度降低，原因是高温条件黄酮类物质会损坏，因此最好的提取时间定为120min。

2.2.4 乙醇体积分数的影响

黄酮类物质在不同体积分数的乙醇溶液中溶解度有所不同，所以提取过程中所用的乙醇溶液的体积分数对提取效果有一定的影响，用不同体积分数的乙醇溶液进行提取，比较其结果，选择最佳乙醇体积分数。由图5可知，用60%乙醇溶液提取效果最好。

图5 乙醇体积分数对提取效果的影响Fig.5 Effect of ethanol concentration on extraction rate of total flavonoids

2.2.5 提取温度的影响

在不同温度条件下进行最佳提取温度的选择，图6结果表明，80℃是最佳的提取温度。

图6 提取温度对提取效果的影响Fig.6 Effect of extraction temperature on extraction rate of total flavonoids

2.2.6 料液比的影响

取4个料液比水平进行试验，表2结果表明，最佳提取料液比为1:30(g/mL)。

表2 料液比对浸提效果的影响Table 2 Effect of material-liquid ration on extraction rate of total flavonoids

2.3 提取工艺条件的优化

表3 正交试验因素水平Table 3 Factors and levels of orthogonal experiments

由表3、4可知，各种因素对提取效果影响的主次顺序为料液比＞提取时间＞提取温度＞乙醇体积分数。琐琐葡萄中黄酮的最佳提取工艺为A2B3C4D3，即提取温度80℃、料液比1:30(g/mL)、乙醇体积分数60%、提取时间120min。

表4 L9(34)的正交试验结果及分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments

3 结 论

结果表明琐琐葡萄果实中黄酮类物质的最大吸光度波长为500nm。从琐琐葡萄中提取黄酮类化合物的最佳工艺：提取温度80℃、乙醇体积分数60%、提取时间120min、料液比1:30(g/mL)。

[1]新疆维吾尔自治区卫生厅. 维吾尔药材标准: 上册[M]. 乌鲁木齐: 新疆科技卫生出版社, 1993: 347.

[2]刘勇民, 沙吾提·伊克木. 维吾尔药志: 上册[M]. 乌鲁木齐: 新疆人民出版社, 1986: 365.

[3]如克娅·沙德克. 维吾尔医常用药材学: 下册[M]. 乌鲁木齐: 新疆科技卫生出版社, 1993: 323.

[4]宋永强, 谌乐刚. 分光光度法测定裸花紫珠片中总黄酮含量[J]. 海南医学, 2005, 16(6): 152-153.

[5]刘香, 刘振, 段更利. 紫外分光光度法测定蜂胶搽剂中总黄酮的含量[J]. 贵阳医学院学报, 2005, 30(3): 230-231.

[6]刘锡建, 李平, 王艳辉. 沙棘果渣中总黄酮提取的研究[J]. 北京化工大学学报, 2005(3): 23-25.

[7]龚珍林, 闫克玉, 贾玉红. 正交试验法优选艾叶总黄酮提取工艺研究[J]. 现代食品科技, 2007(9): 26-28.

[8]白玉霞, 把根那, 伊拉图. 正交设计研究文冠木总黄酮的提取工艺[J]. 中成药, 1998, 20(9): l-3.

[9]黄利华, 赵力超, 张业辉. 荸荠总黄酮不同提取方法的比较研究[J].食品工业科技, 2009, 30(10): 227-229.

[10]吴娜, 张瑞巧, 孙智达. 艾蒿中黄酮类化合物的提取工艺研究[J]. 食品工业科技, 2008, 29(1): 230-232.

[11]韩爱霞, 任彦蓉. 果胶酶对枸杞中总黄酮的提取效果研究[J]. 食品科技, 2009(8): 79-82.

[12]孙春艳, 赵伯涛, 郁志芳, 等. 芦笋茎叶中黄酮类化合物的提取工艺研究[J]. 食品工业科技, 2006, 27(4): 112-114.

Extraction Processing of Total Flavonoids from Vitis vinifera L.

ZULFIYA Yunus. ...
(College of Life Sciences and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, China)

The influence order of the factors on extraction efficiency was material-liquid ratio, extraction time, extraction temperature and ethanol concentration. The optimal extraction processing parameters of total flavonoids from Vitis vinifera L. were explored by single-factor and orthogonal experiments to be extraction temperature of 80℃, ethanol concentration of 60%, extraction time of 120 min and material-liquid ratio of 1:30 (g/mL).

Vitis vinifera L.；total flavonoids；extraction processing

O623.54

A

1002-6630(2010)24-0159-04

2010-01-25

祖丽皮亚·玉努斯(1970—)，女，副教授，硕士，研究方向为资源生物及微生物。E-mail：zulfiya_yunus@126.com