木聚糖酶Shearzyme 500L酶解蔗渣木聚糖的特性研究

石国良，周玉恒，张厚瑞,*，蔡爱华，陈海珊

(1.广西植物研究所，广西 桂林 541006；2.广西师范大学生命科学学院，广西 桂林 541004)

木聚糖酶Shearzyme 500L酶解蔗渣木聚糖的特性研究

石国良1,2，周玉恒1，张厚瑞1,*，蔡爱华1，陈海珊1

(1.广西植物研究所，广西 桂林 541006；2.广西师范大学生命科学学院，广西 桂林 541004)

以木聚糖酶Shearzyme 500L水解蔗渣木聚糖制备低聚木糖，用DNS法测定酶解液中的总糖和还原糖，HPLC法测定酶解产物组成，其适宜的水解条件为底物质量浓度3g/100mL、pH5.0、60℃、木聚糖中酶用量50U/g、水解时间24h。在此条件下底物水解率约为63.1%，水解产物的81.5%为低聚木糖，其中木二糖占54.8%，木三糖占26.7%。Shearzyme 500L不能将一分子木二糖水解为两个木糖单糖，但能水解木三糖并相应生成木二糖与木糖。副产物木糖能显著抑制Shearzyme 500L活性，降低木聚糖的水解率。

木聚糖酶；蔗渣木聚糖；低聚木糖

低聚木糖主要指2～4个木糖以β-1,4-糖苷键连接的聚合物。低聚木糖不仅在动物体内有极为突出的双歧杆菌增殖效果，并具有用量少，耐酸、耐热性强等特点，在食品、医药工业中的特殊应用价值为其他低聚糖所不能替代。

低聚木糖主要用酶法水解木聚糖生产。木聚糖水解酶系主要包括内切木聚糖酶与β-木糖苷酶。内切木聚糖酶以内切方式作用于木聚糖主链内部的β-1,4-糖苷键，作用前期是聚合度较大的低聚木糖，随着水解的深入最后生成以木三糖、木二糖为主要成分的低聚糖。β-木糖苷酶主要水解短链的低聚木糖，并从非还原性末端释放出木糖单糖，木二糖是此酶的最好底物。

低聚木糖的工业化生产所选用的酶制剂除了要有足够的食品卫生安全性之外，它的内切木聚糖酶活力应尽可能高而β-木糖苷酶活力尽可能低，以保证水解产物有较高的木二糖、木三糖含量，有效提高产物品质。

尽管国内关于低聚木糖生产用酶的研究报道已经很多[1-7]，但均限于产木聚糖酶微生物筛选，以及产酶发酵培养、酶的分离纯化、酶学特性等方面，迄今尚未见商业性木聚糖酶制剂用于制备低聚木糖的报道。显然，寻找符合这种要求的木聚糖酶制剂来源，对于推动低聚木糖产业的发展具有重要的意义。

诺维信OR真菌木聚糖酶Shearzyme 500L是一种食品级酶制剂，主要作用于禾本植物木聚糖，对淀粉及蛋白质没有作用。Shearzyme 500L在小麦淀粉湿法生产过程中，用于提高淀粉与谷朊粉的分离效果、缩短分离时间、降低水及能源的消耗[8]；在啤酒酿制中用于改善麦芽汁的澄清过滤性能[9]。本实验研究Shearzyme 500L用于水解蔗渣木聚糖制备低聚木糖的一些酶学特性(最适温度、pH值、酶用量、酶解时间、底物质量浓度等)。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

酶制剂：真菌木聚糖酶500L(Shearzyme 500L) 诺维信生物技术有限公司。

D-木糖、L-阿拉伯糖、木糖醇(样品纯度＞99%)本实验室制备；蔗渣木聚糖按文献[10]方法制备，纯度约80%；木二糖、木三糖标准品 日本和光纯药工业株式会社；其他试剂为国产分析纯。

T6紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；HY-M1001强酸性阳离子交换树脂、HY-M 2007强碱性阴离子交换树脂 北京海德能科技有限公司； Waters 510高效液相色谱仪 美国Waters公司；HH-S数显恒温水浴锅 金坛市正基仪器有限公司；PHS-3C型精密pH计 上海雷磁仪器厂；XM60水分分析仪、XS225A-SCS分析天平 瑞士普利赛斯公司。

1.2 方法

1.2.1 温度对Shearzyme 500L木聚糖酶活性的影响

酶反应的最适温度：在不同温度(30～95℃)条件下，按酶活测定方法测定酶的活性。以最高活性为100%，计算各温度下酶的相对活力。

酶的温度稳定性：将适量酶液与0.05mol/L、pH5.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液在不同的温度(30～95℃)保温2h，立即在0℃冰箱中冷却，测定酶的活性，以室温(25℃)未经保温处理时测定的酶活性为100%。

1.2.2pH值对Shearzyme 500L木聚糖酶活性的影响

酶反应的最适pH值：在不同pH值范围(3～8)的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制的木聚糖溶液中测定酶的活性。以最高活性为100%，计算各pH值下酶的相对活力。

酶的pH值稳定性：将适量酶液与不同pH值的缓冲液在室温(25℃)放置2h，测定酶的活性，以未用缓冲液处理的酶活性为100%，计算相对酶活力。

1.2.3 酶用量对水解液中还原糖和总糖的影响

底物质量浓度2g/100mL的木聚糖溶液，按10～ 250U/g底物加入酶液，于60℃条件下反应24h，测定水解液中还原糖和总糖含量。

1.2.4 酶解时间对水解液中还原糖、总糖以及产物成分的影响

底物质量浓度2g/100mL的木聚糖溶液，在底物中按50U/g加入酶液，于60℃条件下反应，间隔一定时间取样测定还原糖、总糖含量和酶解产物。

1.2.5 底物质量浓度对水解液中还原糖和总糖的影响

底物质量浓度2～10g/100mL的木聚糖溶液，在底物中按50U/g加入酶液，于60℃条件下反应24h，测定还原糖和总糖含量。

1.2.6 酶活和还原糖含量测定

酶活测定使用DNS法[11]：1.8mL 2g/100mL蔗渣木聚糖悬浮液(pH5.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制)，加入0.2mL适当稀释的酶液(空白对照加入灭活的酶液)，70℃精确反应5min，取0.2mL反应液，加入0.5mL DNS试剂，沸水显色5min，迅速冷却后定容至5mL，于紫外-可见分光光度计测定520波长处吸光度。以木糖的毫克数为横坐标，以吸光度A520nm为纵坐标，绘制标准曲线。

酶活力定义为每分钟分解蔗渣木聚糖产生1μmol木糖所需的木聚糖酶量为1个酶活力单位(U)。

还原糖含量测定：0.2mL适当稀释的糖液(空白对照为纯水)，加入0.5mL DNS试剂，沸水显色5min，迅速冷却后定容至5mL，于紫外-可见分光光度计测定520nm波长处吸光度。木糖含量与A520nm存在以下对应关系：

木糖含量/(mg/mL)=0.7646×A520nm＋0.1186

1.2.7 总糖含量测定

15mL低聚木糖溶液，加入5mL 0.8mol/L H2SO4配成终浓度0.2mol/L H2SO4溶液，100℃水解2h，用NaOH溶液调节pH值到7.0，稀释一定倍数后，按1.2.6节方法测定总还原糖含量。

木聚糖总糖含量=总还原糖含量×0.9

1.2.8 酶解产物成分分析

高效液相色谱法：用适量水将酶解溶液稀释至总糖含量约10g/L，取10mL稀释液加3g HY-M2007强碱性阴离子交换树脂，1g HY-M1001强酸性阳离子交换树脂脱盐净化，净化液经0.22μm水性微孔滤膜过滤得检测样品。Waters 510高效液相色谱仪，410示差折光检测器。色谱柱，BC-100碳水化合物Ca2+柱。流动相：超纯水1mL/min，柱温80℃。分别取标准样品于60℃烘干至质量恒定，用超纯水配制成质量浓度10.0g/L。

纸层析展开剂：正丁醇:吡啶:水= 4:3:3(V/V)；显色剂：水饱和的正丁醇配制，含2g/100mL二苯胺、体积分数2%邻苯二甲酸溶液，喷雾后加热显色。

2 结果与分析

2.1 酶解产物的组成

HPLC结果(图1)显示蔗渣木聚糖经Shearzyme 500L充分水解后，产物主要为木二糖和木三糖，还有少量的木糖。其中木二糖约占总糖的54.77%、木三糖占26.7%、木糖约7%。纸层析结果(图2)也验证了产物主要为木二糖和木三糖以及木糖。

图1 酶解产物的HPLC流出曲线Fig.1 HPLC elution profile of hydrolysates of bagasse xylan

图2 酶解产物纸层析结果Fig.2 Paper chromatography analysis result of hydrolysates of bagasse xylan

目前研究的大多数木聚糖酶水解产物中木二糖所占比例均较低(30%左右)[12]，杨瑞金等[13]采用蒸煮法提取玉米芯木聚糖后加酶水解生产低聚木糖得到了54.1%木二糖和19.8%木三糖，其中还含有7.7%阿拉伯糖和6.8%葡萄糖以及11.5%木糖；黄家骥[14]用Bacillus pumilus WUN024产木聚糖酶水解玉米芯木聚糖，精制后只获得了65.52%的木二糖和木三糖低聚木糖溶液；张东华[15]用木霉TF(拟康氏木霉Trichoderma pseudokongii TF)在实验室水平的水解产物中低聚木糖含量为89.877%，但是其中除了木二糖和木三糖之外还有木四糖到木六糖的寡糖成分。相比之下，Shearzyme 500L水解蔗渣木聚糖产物中主要成分木二糖和木三糖占总糖比例高达81.5%，这说明用Shearzyme 500L水解木聚糖，可以获得高含量低聚木糖的水解产物。

2.2 温度对Shearzyme 500L木聚糖酶活性的影响

Shearzyme 500L的酶活性随温度而升高，并在85℃时达到最大值，此后温度继续升高则酶活性急剧下降；酶活性在60℃以下表现相对稳定，温度变化对残余酶活性的影响不大，高于60℃之后的酶稳定性明显下降，残余酶活性随温度升高而快速下降(图3)。

图3 温度对木聚糖酶活性及稳定性的影响Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on the activity and stability of xylanase

在湿法生产小麦淀粉的过程中，使用Shearzyme 500L的目的是加速淀粉粒的沉淀，改善谷朊分离澄清效果。啤酒酿制使用Shearzyme 500L，主要目的是改善过滤性能。它们都没有将木聚糖彻底水解为木二糖与木三糖的要求，所以总体处理时间都比较短。对于低聚木糖生产而言，为避免水解物停留在聚合度较高的阶段通常需要水解比较长时间，以获得木二糖和木三糖含量较高的水解产物。显然，低聚木糖生产所用的水解温度不宜太低，否则长时间的水解过程易造成微生物污染。由图3看出，Shearzyme 500L用于低聚木糖生产的适宜温度可设定在60℃左右，因为这一温度条件不仅可以满足防污染的要求，而且Shearzyme 500L仍表现有较高的木聚糖酶活性，经较长保温时间之后的酶活性仍不会显著降低。

2.3 pH值对Shearzyme 500L活性的影响

图4 pH值对木聚糖酶活性及稳定性的影响Fig.4 Effect of hydrolysis pH on the activity and stability of xylanase

pH值变化对Shearzyme 500L酶活性影响明显，对酶稳定性的影响则相对微弱(图4)。总的趋势是，Shearzyme 500L的最适pH值在5.0左右，在此条件下稳定性也最好。因此，Shearzyme 500L用于低聚木糖生产时，所选择的pH值在5.0为宜，它与用于小麦淀粉生产所用的最适pH值一致。

Shearzyme 500L用于低聚木糖与用于小麦淀粉制造的最适pH值一致，这种现象可从两方面理解，其一，Shearzyme 500L在pH5条件下的酶蛋白构象或解离状态具有较高的催化活力；其二，小麦木聚糖与蔗渣木聚糖一样，在pH5条件下的解离状态易于与酶的结合。

2.4 酶用量对水解液中还原糖和总糖的影响

图5 酶用量与还原糖和总糖的关系Fig.5 Effect of enzyme addition amount on the contents of total sugar and reducing sugar in hydrolysates

随着Shearzyme 500L酶用量的增加，水解体系中的还原糖和总糖含量也相应增加，当底物中酶用量达到50U/g之后，继续增加酶用量，已经不会显著增加水解体系中的还原糖和总糖含量总量(图5)。说明50U/g酶用量已经足够充分水解溶液中的木聚糖。选择Shearzyme 500L水解木聚糖制备低聚木糖时，以50U/g的酶用量为适宜。

低聚木糖生产的酶用量因底物、酶源不同而有所差异。黄家骥[14]用酶法水解玉米芯木聚糖制备低聚木糖，其工艺条件为底物中加酶量为800U/g；蒋琦霞等[16]酶水解爆破秸秆制备低聚木糖，干基中黑曲霉木聚糖酶添加量为198U/g；朱孝霖等[17]以耐热木聚糖酶水解法制备木寡糖酶用量为100U/g，薛文通等[18]以卷须链霉菌(Streptomyces cirratus D-10)木聚糖酶水解碱提玉米芯木聚糖的合适酶用量为60U/g。相比之下，蔗渣木聚糖底物中Shearzyme 500L酶用量为50U/g，说明Shearzyme 500L具有较高的酶解效率，用少量的酶就可以将蔗渣木聚糖中的可酶解性糖水解出来。

2.5 酶解时间对酶解产物的影响

分析水解液中木糖、木二糖与木三糖之间的比例可以发现，Shearzyme 500L水解蔗渣木聚糖4h，反应体系中木三糖所占比例达到极大植，此后木三糖比例持续下降，木二糖比例则相应上升，木糖所占比例明显随木三糖降低的比例而相应升高(图6)。这表明，Shearzyme 500L具有水解木三糖的活性，并相应生成木二糖与木糖，但它并不能将一分子木二糖水解为两个木糖单糖。

图6 酶解时间对产物中主要成分所占比例的影响Fig.6 Effect of hydrolysis time on the proportion of major components in hydrolysates

水解24h之后，木三糖、木二糖、木糖单糖之间的比例达到平衡，继续延长水解时间，它们之间的比例变化已经不明显(图6)。木二糖是低聚木糖最主要的活性成分，木二糖含量水平是低聚木糖最重要的质量指标。显然，要获得高木二糖含量的低聚木糖产品，Shearzyme 500L的水解底物的时间应达到24h。

2.6 底物质量浓度对水解的影响

图7 底物质量浓度对还原糖和总糖的影响Fig.7 Effect of substrate concentration on the contents of total sugar and reducing sugar in hydrolysates

还原糖和总糖含量在2～10g/100mL的底物质量浓度范围内，随底物质量浓度的增加而增加，但水解率却随着底物质量浓度的增加而降低(图7)。底物质量浓度较低时，得到的还原糖和总糖含量相应较少是容易理解的。随着底物质量浓度的增加水解率降低，虽然可能包括底物质量浓度的增加，反应体系的黏稠性增加，影响了酶、底物和产物的扩散以及酶与底物的接触，从而降低了酶促反应速度的因素，但最主要原因应当是反应产物对酶活性的抑制作用。反应进行到一定阶段时，产物含量增加到一定浓度的时候，酶促反应速率就会降低。

Shearzyme 500L水解蔗渣木聚糖结果表明，当酶解产物中木糖含量达到(7.53±1.10)g/L时，就显著抑制Shearzyme 500L活性，使底物不能水解，所以只能用较低的底物质量浓度。酶法生产低聚木糖水解率一般在40%～66%[14,19-20]，相比之下，Shearzyme 500L水解3g/ 100mL底物的蔗渣木聚糖水解率可达63.1%；从图7结果可知，当底物质量浓度超过3g/100mL，水解率会急剧下降，所以控制在3g/100mL为宜。为提高底物的利用率，应找寻去除产物抑制的途径。

3 结 论

Shearzyme 500L木聚糖酶水解蔗渣木聚糖的产物以低聚木糖为主要成分，充分水解之后产物中的木二糖、木三糖占总还原糖的81.5%，其中木二糖54.8%、木三糖26.7%。它是具有工业应用价值的低聚木糖生产用酶。

Shearzyme 500L耐高温性能好，在60℃保温2h后仍有高于96%的活性。良好的耐高温性能有利于减少生产过程的微生物污染，适当延长水解时间，使底物得以充分水解。

水解副产物木糖不是活性成分，但能显著抑制Shearzyme 500L活性，降低木聚糖的水解率。虽然Shearzyme 500L不能将一分子木二糖水解为两个木糖单糖，但能水解木三糖并相应生成木二糖与木糖。木二糖是低聚木糖最主要的活性成分，因此寻找有效手段去除副产物木糖，就能提高Shearzyme 500L的使用效率与底物的利用率，并获得高木二糖含量的水解产物。

[1]代义, 吕淑霞, 林英, 等. 高产木聚糖酶菌株筛选、鉴定及产酶条件的研究[J]. 生物技术, 2008, 18(2): 70-73.

[2]吴萍, 史钧, 李正鹏. 黑根霉固态发酵产木聚糖酶的研究[J]. 中国酿造, 2007(9): 26-28.

[3]包怡红, 李雪龙. 木聚糖酶产生菌: 类芽孢杆菌的筛选及其酶学性质研究[J]. 中国食品学报, 2008, 8(2): 36-41.

[4]YAN Qiaojuan, WANG Lan, JIANG Zhengqiang, et al. A xylosetolerant β-xylosidase from Paecilomyces thermophila: characterization and its coaction with the endogenous xylanase[J]. Bioresource Technology, 2008, 99: 5402-5410.

[5]LI Lite, TIAN Hongmei, CHENG Yongqiang, et al. Purification and characterization of a thermostable cellulase-free xylanase from the newly isolated Paecilomyces themophila[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2006, 38: 780-787.

[6]PUCHART V, BIELY P. A simple enzymatic synthesis of 4-nitrophenyl β-1,4-D-xylobi-oside, a chromogenic substrate for assay and differentiation of endoxylanases[J]. Journal of Biotechnology, 2007, 128(3): 576-586.

[7]YANG Chaohsun, YANG Shufeng, LIU Wenhsiung. Production of xylooligosaccharides from xylans by extracellular xylanases from Thermobifida fusca[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(10): 3955-3959.

[8]发酵论坛: 酶应用专题. 诺维信酶制剂在谷物加工工业中的应用[EB/ OL]. (2009-12-21). http://www.fjmate.com/simple/index.php?t14519. htmL.

[9]杨观中. 真菌木聚糖酶在小麦啤酒酿造中的应用[J]. 酿酒, 2007, 34 (1): 51-53.

[10]何成新, 张厚瑞, 曾健智, 等. 不溶性着色蔗渣木聚糖检测木聚糖酶活性[J]. 微生物学通报, 2003, 30(1): 45-48.

[11]钱铭镛. 发酵工程最优化控制[M]. 南京: 江苏科学技术出版社, 1998: 306-308.

[12]郝珊珊. 闫巧娟. 江正强. 等. 1株具有高产木二糖的产木聚糖酶马特链霉菌的鉴定[J]. 食品与发酵工业, 2008, 34(6): 37-40.

[13]杨瑞金, 许时婴, 王璋. 低聚木糖的功能性质与酶法生产[J]. 中国食品添加剂, 2000(2): 89-93.

[14]黄家骥. 酶法水解玉米芯木聚糖制备低聚木糖[D]. 无锡: 江南大学, 2004.

[15]张东华. 寡聚木糖生产用酶生产菌株筛选-酶的生产-分离纯化及应用机制研究[D]. 山东: 山东大学, 2005.

[16]蒋琦霞, 杨瑞金, 丛明, 等. 酶水解爆破秸秆制备低聚木糖[J]. 食品与发酵工业, 2006, 32(11): 72-77.

[17]朱孝霖, 李环, 韦萍. 耐热木聚糖酶水解法制备木寡糖的研究[J]. 饲料工业, 2008, 29(12): 39-42.

[18]薛文通, 张艳艳, 范俊峰, 等. 卷须链霉菌D-10木聚糖酶酶解玉米芯汽爆液制备低聚木糖的研究[J]. 食品科学, 2004, 25(增刊1): 138-144.

[19]洪枫, 余世袁. 选择性控制酶水解玉米芯木聚糖制备低聚木糖[J]. 林产化学与工业, 2005, 25(增刊1): 77-81.

[20]OZLEM A, OZLEM A, AYSEGUL K, et al. Enzymatic production of xylooligos-accharides from cotton stalks[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55: 5544-5551.

Enzymatic Hydrolysis Properties of Bagasse Xylan by Xylanase Shearzyme 500L

SHI Guo-liang1,2，ZHOU Yu-heng1，ZHANG Hou-rui1,*，CAI Ai-hua1，CHEN Hai-shan1
(1. Guangxi Institute of Botany, Guilin 541006, China；2. College of Life Sciences, Guangxi Normal University, Guilin 541004, China)

Xylanase Shearzyme 500L was used to hydrolyze bagasse xylan for preparing xylooligosaccharide. DNS was used to determine the contents of total sugar and reducing sugar in hydrolysates and HPLC was used to determine the compositions of hydrolysates. The optimal hydrolysis conditions were substrate concentration of 3 g/100 mL, hydrolysis pH of 5.0, hydrolysis temperature of 60 ℃, enzyme addition amount of 50 U/g and hydrolysis time of 24 h. Under the optimal hydrolysis conditions, the hydrolysis rate of bagasse xylan was approximately 63.1%, and the xylooligosaccharide in hydrolysates was up to 81.5%, which included 54.8% xylobiose and 26.7% xylotriose. Xylotriose could be hydrolyzed to xylobiose and xylose by xylanase shearzyme 500 L, but xylobiose could not be hydrolyzed to xyloses. The by-product xylose could also obviously suppress the activity of xylanase shearzyme 500 L and reduce the hydrolysis rate of bagasse xylan.

xylanase；bagasse xylan；xylooligosaccharide

Q556.2

A

1002-6630(2010)24-0102-05

2010-02-26

广西自然科学基金资助项目(桂科自0832221)

石国良(1984—)，男，硕士研究生，研究方向为生物化学与分子生物学。E-mail：gxsdsgl@126.com

*通信作者：张厚瑞(1954—)，男，研究员，研究方向为生物质精炼、生物转化与功能性糖。E-mail：zh-hr@hotmail.com