响应面法优化微波提取野菊花抗氧化物质

褚福红，陆 宁，于 新*，蒋 雨

(1.安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽 合肥 230036；2.仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东 广州 510225；3.四川农业大学食品学院，四川 雅安 625014)

响应面法优化微波提取野菊花抗氧化物质

褚福红1,2，陆 宁1，于 新2,*，蒋 雨3

(1.安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽 合肥 230036；2.仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东 广州 510225；3.四川农业大学食品学院，四川 雅安 625014)

以野菊花花蕾为材料，研究其提取物的抗氧化活性。在乙醇体积分数、提取时间、料液比等单因素试验的基础上，根据中心组合试验设计原理，应用响应面分析法研究各因素的显著性和交互作用的强弱，对野菊花微波提取工艺进行优化。结果表明，微波提取野菊花清除DPPH自由基物质的优化工艺条件为乙醇体积分数50%、料液比1:27(g/mL)、提取时间51s。提取物质量浓度为0.6mg/mL时，DPPH自由基实际清除率达到83.23%，与理论预测值83.10 %的绝对误差为0.13%。

响应面分析法；野菊花；微波提取；DPPH自由基

野菊花为菊科植物野菊(Chrysanthemum indicum L.)的头状花序，中药材常用其花蕾，具有清热解毒、凉肝明目之功效[1]。野菊花中主要含有黄酮类化合物[2]、绿原酸[3]、多糖[4]以及多种挥发油成分和脂肪族化合物[5]。近年来的研究表明其具有抗病毒、抗感染、降压、抗肿瘤、提高机体免疫及抗氧化等众多药理作用。资料显示，自由基损伤机体是加速人体老化的重要诱因[6]。我国野菊花分布广泛，野菊花多糖具有清除活性氧自由基的作用[4]；其水提液对离体大鼠心、脑、肝、肾的脂质过氧化物(LPO)以及H2O2引发的红细胞LPO和红细胞溶血有不同程度的抑制作用，还可提高体内抗氧化酶的活力[7]；野菊花挥发油具有清除DPPH自由基活性的作用[8]。目前，响应面分析法在优化微波辅助提取野菊花抗氧化物质中的应用未见报道。

微波作为一种新型的技术近年来广泛应用于植物化学领域[9]，它具有加热速度快、控制方便、受热体系温度均匀、节能等优点[10-11]。DPPH自由基是一种人工合成的稳定的自由基，在可见光区有特征吸收，比色测定简便快速，并具有良好的重现性，可有效评价物质的抗氧化性[12]。本实验利用微波技术研究野菊花提取物对DPPH自由基的清除率，在单因素试验的基础上，通过响应面分析法[13-14]以最经济的方式对所选实验参数进行全面的分析和研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

野菊花[岩香菊(C.lavandulaefolium(Fisch.)Mak.)的头状花絮] 广州市大参林药房；1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH自由基) 美国Sigma公司；无水乙醇(分析纯) 广州化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

FA1004电子分析天平 上海恒平科学仪器有限公司；MJ-176NR型多功能粉碎机 日本松下电器产业株式会社；HH数显恒温水浴锅 金坛市金城国胜实验仪器厂；G8023CSL-K3型微波炉 格兰仕微波炉有限公司；UV-1700紫外分光光度计 日本岛津分析仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 提取物对DPPH自由基清除率的测定

参照Vattem等[15]报道，配制不同浓度的提取物溶液，精确吸取2.0mL放入试管中，加入2.0×10-4mol/L DPPH自由基溶液2.0mL，摇匀后30℃放置30min，测定其在517nm波长处的吸光度(AS)；以蒸馏水代替样品为空白对照(A0)；以2.0mL不同浓度的提取物溶液与2.0mL水混合液为样品对照(AX)，以消除样品本身颜色的影响。

1.3.2 工艺优化设计

1.3.2.1 单因素试验

分别考察溶剂、料液比、提取时间等因素对野菊花微波提取物清除DPPH自由基的影响，设3次重复。

1.3.2.2 中心组合试验设计

表1 试验因素水平及编码Table 1 Factors and levels of response surface experiments

结合单因素试验结果，选取乙醇体积分数、提取时间和料液比为野菊花微波提取物清除DPPH自由基影响的3个因素，采用三因素三水平的(central composite design，CCD)试验设计(表1)及分析方法进行提取条件的优化。

2 结果与分析

2.1 溶剂的选择

将野菊花粉碎过100目筛，分别用水、无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等不同极性的溶剂在70℃下回流提取4h，结果如图1所示。水提物的DPPH自由基清除率最高，而氯仿提取物的DPPH自由基清除率最低，总的趋势随着提取溶剂极性的增强，野菊花提取物的抗氧化活性不断提高。因此，选择水和不同体积分数的乙醇为提取溶剂。

图1 不同溶剂对DPPH自由基清除率的影响Fig.1 Effects of different solvents on the scavenging rate of extractfrom Chrysanthemum indicum L. to DPPH free radicals

2.2 单因素试验结果

2.2.1 乙醇体积分数对提取物清除DPPH自由基的影响在料液比1:20(g/mL)、提取时间30s、微波功率

320W的条件下，设定提取溶剂分别为水、30%乙醇、

50%乙醇、70%乙醇(均为体积分数)，试验结果见图2。

图2 乙醇体积分数对DPPH自由基清除率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on the scavenging rate of extract from Chrysanthemum indicum L. to DPPH free radicals

在微波条件下，不同体积分数乙醇提取物对DPPH自由基的清除率大于水提物，50%乙醇提取物对DPPH自由基的清除率最高，其次是70%和30%的乙醇提取物。这首先是因为微波辅助会对强极性的溶剂提取显示出优势，其次有一定量的有机试剂存在会提高提取效率。

2.2.2 提取时间对提取物清除DPPH自由基的影响

在料液比1:20(g/mL)、提取溶剂体积分数50%乙醇、微波功率320W的条件下，设定提取时间分别为10、20、30、40、50、60、70s。结果如图3所示，在50s之前随着时间的延长，DPPH自由基清除率不断提高，50s之后就出现下降趋势。这表明，微波萃取的活性物质浸出过程与时间密切相关，时间过短，产物溶解不充分，但时间过长，活性物质有所破坏或被分解。

图3 提取时间对DPPH自由基清除率的影响Fig.3 Effect of extraction time on the scavenging rate of extract from Chrysanthemum indicum L. to DPPH free radicals

2.2.3 料液比对提取物清除DPPH自由基的影响

在乙醇体积分数50%、微波功率320W、提取时间50s的条件下。设定料液比分别为1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35(g/mL)，结果见图4。

图4 料液比对DPPH自由基清除率的影响Fig.4 Effect of material-liquid ratio on the scavenging rate of extract from Chrysanthemum indicum L. to DPPH free radicals

由图4可知，随着溶剂量提高，DPPH自由基的清除率先提高后降低，在料液比为1:25(g/mL)时清除率达到最高。前期溶剂量越大，有效成分浸出越完全，DPPH自由基的清除率也就越高；但溶剂量过多，一方面造成溶剂的浪费和能耗的增加，另一方面对微波效率也会有影响，因此确定料液比1:25(g/mL)比较合理。

2.3CCD试验设计结果与分析

2.3.1 模型的建立及其显著性检验

结合单因素试验结果，选取乙醇体积分数、微波时间、液料比这3个因素，采用三因素三水平的CCD试验设计(表2)及分析方法进行提取条件的优化。

表2 响应面试验结果Table 2 Results of response surface experiments

利用Design expert V 7.0.0统计软件对数据进行回归拟合，得到野菊花提取物的抗氧化活性对以上3个因素的二次多项回归模型为：

Y/%=-1.90＋1.78x1＋3.37x2-0.19x3-0.022x1x2＋9.81×10-3x1x3＋0.015x2x3-0.017x12-0.057x22-7.03× 10-3x32

表3 回归方程可信度分析Table 3 Reliability analysis for the regression equation

回归方程可信度分析见表3，其中R2=0.9823，表明98.23%的实验数据可用该模型进行解释；信噪比为26.506，远大于4；CV值为0.54%，很低，显示实验稳定性好，操作可信。该回归方程为优化提取野菊花中清除DPPH自由基的物质提供了一个良好的工艺条件模型。

表4 二次回归方程模型方差分析Table 4 Variance analysis of the quadratic regression model

由表4可见，模型具有高度显著性(P＜0.0001)，失拟项不显著，又由各因素的P值可知除提取时间无显著影响(P=0.1432)，乙醇体积分数(P=0.0484)具显著影响外，其他各因素如二次项、方程交互项对野菊花提取物清除DPPH自由基的能力都有极显著影响。响应值的变化相当复杂，各个具体试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系。由表4中F值的大小可以判断各因素对DPPH自由基清除率影响的强弱。F值越大，影响作用越强。各个因素对DPPH自由基清除率的影响程度大小的次序为料液比＞乙醇体积分数＞提取时间，其中料液比对DPPH自由基清除率的影响达到极显著水平(P＜0.0001)。

2.3.2 响应曲面分析与优化

比较图5可知：料液比对DPPH自由基清除率的影响最为显著，表现为曲线较陡；乙醇体积分数、微波提取时间次之，表现为曲线较为平滑，且随其数值的增加或减少，响应值变化较小。从图5A可以看出，响应面曲线较陡，说明料液比和乙醇体积分数对DPPH自由基清除率的影响较为明显，这与方差分析的结果相一致。图5中等高线的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反。由图5A等高线可以看出，料液比和乙醇体积分数之间的交互作用较显著，表现为等高线呈椭圆形。相比较而言，乙醇体积分数和提取时间之间的交互作用较小。回归模型预测的野菊花提取物清除DPPH自由基的最佳工艺条件为乙醇体积分数49.68%、料液比1:26.98(g/mL)、提取时间50.59s，此时野菊花提取物对DPPH自由基的理论值达到了83.10%。为检验响应面法所得结果的可靠性，采用上述优化提取条件进行野菊花微波提取，考虑到实际操作的便利，将提取工艺参数修正为乙醇体积分数50%、料液比1:27(g/mL)、提取时间51s，结果得出DPPH自由基清除率实际值为83.23%。与理论预测值83.10%非常接近。因此，基于响应面法分析所得的优化提取工艺参数准确可靠，具有实用价值。

图5 各因素交互作用对野菊花提取物清除DPPH自由基影响的响应面和等高线Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction of any two factors on the scavenging rate of extract from Chrysanthemum indicum L. to DPPH free radicals

3 结 论

响应面优化微波提取野菊花抗氧化物质工艺试验结果表明，料液比显著影响野菊花提取物对DPPH自由基的清除率(P＜0.0001)。综合分析回归模型确定最佳的工艺条件为乙醇体积分数50%、料液比1:27(g/mL)、提取时间51s，结果得出DPPH自由基清除率实际值为83.23%，与理论预测值的拟合度较好。

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Optimization of Microwave Extraction Conditions for Antioxidant Materials from Chrysanthemum indicum L. by Response Surface Methodology

CHU Fu-hong1,2，LU Ning1，YU Xin2,*，JIANG Yu3
(1. College of Tea & Food Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China；2. College of Light Industry and Food Science, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China；3. Food Science College, Sichuan Agricultural University, Ya， an 625014, China)

Chrysanthemum indicum L. was used as the raw material to extract antioxidant materials by microwave technology. On the basis of single-factor experimental results and central composite design principle, the optimal extraction processing parameters were explored by response surface experiments through evaluating the effects of ethanol concentration, extraction time, material-liquid ratio and their cross-interactions on antioxidant activity of the extract. Results indicated that the optimal extraction processing parameters were ethanol concentration of 50% (V/V), microwave treatment time of 51 s and material-liquid ratio of 1:27 (g/mL). Under these optimal extraction conditions, the scavenging rate of the extract from Chrysanthemum indicum L. at the concentration of 0.6 mg/mL on DPPH free radicals was up to 83.10%, which was close to the predicted value of 83.23% with an absolute error of 0.13%.

response surface method (RSM)；Chrysanthemum indicum L.；microwave extraction；DPPH free radicals

TS201；Q946

A

1002-6630(2010)24-0090-05

2010-02-02

广东省科技计划项目(2005B20401002)

褚福红(1985—)，女，硕士研究生，研究方向为农产品加工与贮藏。E-mail：fish_fish777@126.com

*通信作者：于新(1959—)，男，教授，硕士，研究方向为农产品加工与贮藏。E-mail：yuxin1959@yahoo.com.cn