侧柏籽油的超声辅助提取及其脂肪酸组成分析

麻成金，吴竹青，黄 伟，肖卓炳，黄 群

(1.林产化工工程湖南省重点实验室，湖南 张家界 427000；2.吉首大学 食品科学研究所，湖南 吉首 416000)

侧柏籽油的超声辅助提取及其脂肪酸组成分析

麻成金1,2，吴竹青2，黄 伟2，肖卓炳1，黄 群2

(1.林产化工工程湖南省重点实验室，湖南 张家界 427000；2.吉首大学 食品科学研究所，湖南 吉首 416000)

以环己烷为提取溶剂，采用响应面法(RSM)优化超声波辅助提取侧柏籽油的工艺条件，在单因素试验基础上，选取液料比、提取时间、提取温度、超声波功率为影响因素，以侧柏籽油提取率为响应值，应用中心组合试验设计(central composite design，CCD)建立数学模型，进行响应面分析，并采用GC-MS测定侧柏籽油的脂肪酸组成。结果表明，提取侧柏籽油的优化工艺条件为：液料比7:1(mL/g)、提取时间38min、提取温度55℃、超声波功率270W，在此工艺条件下，侧柏籽油提取率为93.47%；GC-MS测定结果表明侧柏籽油中富含不饱和脂肪酸，总含量达到84.37%，其中油酸、亚油酸和亚麻酸的含量分别为28.41%、11.40%和44.56%。

侧柏籽油；超声波辅助提取；工艺条件；响应面分析；气相色谱-质谱分析

侧柏(Biota orientalis (L.) Endl.)为柏科侧柏属常绿乔木，侧柏球果每年9～10月份成熟，为阔卵形，近熟时蓝绿色被白粉，种鳞木质，红褐色，种鳞4对，熟时张开，背部有一反曲尖头，种子脱出，种子卵形，灰褐色，无翅，有棱脊[1]。目前，国内外对侧柏的研究主要集中在其生物学特性、种子的特性及发芽技术、苗木的种植技术以及叶挥发油提取和组分测定、种子脂肪酸组成初步分析等[1-2]，侧柏籽油可作为功能性植物油脂或高档化妆品加工原料，目前未见关于侧柏籽油提取的文献报道。

超声辅助提取技术是一种新型的提取分离技术，利用超声波的空化作用(破碎细胞)和机械作用(强化传质)，使溶剂分子渗透到组织细胞中去，使细胞中可溶性成分与之接触而更易释放出来[3]，在提取植物油脂方面具有独特的优势。本研究旨在探讨影响超声辅助提取侧柏籽油的诸因素，通过单因素试验和中心组合试验设计(CCD)以及响应面分析对超声辅助提取侧柏籽油的工艺条件参数进行优化，并对侧柏籽油进行气相色谱-质谱(GC-MS)分析，为侧柏籽资源的利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

侧柏籽：2009年9月中旬采摘于湖南省凤凰县腊尔山镇，取出种籽干燥后密封保存；石油醚、环己烷、氢氧化钾、无水硫酸钠、甲醇等均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

KQ-250E超声波清洗器 昆山市超声波仪器制造厂；RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；CDE-220E2多功能食品处理机 佛山市顺德区欧科电器有限公司；HH.S精密恒温水浴锅 江苏金坛市医疗仪器厂；GZX-9146MBE电热鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；JA2003电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司；GCMS-QP2010气-质联用分析仪 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程及操作要点

工艺流程：侧柏果实→取籽→侧柏籽→干燥→粉碎→过筛→超声辅助提取→过滤→蒸发溶剂→干燥→侧柏籽油。

将采摘的侧柏果实堆放在阴凉通风处，待外壳开裂后，取出种籽，除杂，干燥后粉碎过筛，密封保存备用。准确称取一定量侧柏籽粉，放入钢化玻璃杯中按不同液料比加入提取溶剂环己烷，进行超声波辅助提取，处理完后用抽滤法分离出混合液中固体，液体部分用旋转蒸发仪分离环己烷，待环己烷基本挥发完后，将含油部分放在100℃的烘箱中干燥至质量恒定，称质量，计算提取率[4-5]。

1.3.2 侧柏籽油脂含量的测定

采用索氏提取法，按GB/T5009.6—2003《食品中脂肪的测定》标准进行测定，实验平行进行3次，结果以平均值表示。原料油脂的含量按如下公式计算：

1.3.3 单因素试验

选用液料比(环己烷体积与侧柏籽质量之比)、提取时间、提取温度、超声波功率作为考察因素，每次试验侧柏籽粉用量为50g，以侧柏籽油提取率作为指标进行单因素试验，探讨各因素变化对侧柏籽油提取率的影响[3-5]。

1.3.4 响应面优化试验

在单因素试验基础上，根据中心组合试验设计(CCD)原理，选取液料比(X1)、提取温度(X2)、提取时间(X3)和超声波功率(X4)作为考察变量，以侧柏籽油提取率(Y)为响应值，采用4因素5水平的响应面分析法，对侧柏籽油的超声辅助提取工艺参数进行优化[7-20]。

1.3.5 侧柏籽油的GC-MS分析

1.3.5.1 油脂的甲酯化处理

取侧柏籽油0.35～0.4mL，加入1mol/L KOH甲醇溶液6mL，摇均匀，在40℃水浴中进行甲酯化处理2～3h后，加入正己烷6mL，摇匀并静置一定时间，取上层液用二次蒸馏水洗涤2～3次，无水Na2SO4脱水，然后取样进行GC-MS检测分析[6-7]。

1.3.5.2GC-MS条件

GC条件：采用RTX-5MS型弹性石英毛细管柱(30m ×0.25m，0.25μm)；载气为高纯氦气(99.999%)，柱前压119.4kPa，柱内载气流量1.3mL/min；升温程序：从150℃开始，保持2min，以10℃/min升温到220℃，220℃保持2min，以5℃/min升温到280℃，280℃保持3min，汽化室温度为250℃；进样量为1μL。

MS条件：采用EI离子源，离子源温度200℃，接口温度270℃，溶剂延时3min，电子能量70eV，扫描范围为40～550u，分辨率为1000。

2 结果与分析

2.1 侧柏籽含油量测定

采用索氏提取法测定侧柏籽的油脂百分含量，进行3组平行实验，测定结果分别为7.28%、7.23%、7.30%，平均值7.27%，即本实验所用侧柏籽的油脂含量为7.27%。

2.2 单因素试验

2.2.1 液料比对侧柏籽油提取率的影响

在超声波功率250W，提取时间20min，提取温度45℃条件下，不同液料比对侧柏籽油提取率的影响如图1所示。

图1 液料比对侧柏籽油提取率的影响Fig.1 Effect of liquid-to-material ratio on the yield of oil from Biota orientalis seed

由图1可知，当液料比较小时，随着溶剂用量的增加，侧柏籽油提取率逐渐增大，当液料比达到8:1 (mL/g)时，提取率达到最大值，继续增大液料比提取率略有下降。这可能是由于前期溶剂量越大，油脂浸出越完全，提取率也就越大；但当溶剂过大时，超声能量对沉滞在底层的侧柏籽颗粒的空化和机械等效应的强度减弱，从而影响超声提取的效果，同时会造成溶剂和能源的浪费，并给后序的浓缩工作带来困难[3]，故选择液料比为8:1(mL/g)左右较适宜。

2.2.2 提取时间对侧柏籽油提取率的影响

在液料比8:1(mL/g)，超声波功率250W，提取温度45℃条件下，不同提取时间对侧柏籽油提取率的影响如图2所示。

图2 提取时间对油提取率的影响Fig.2 Effect of extraction time on the yield of oil from Biota orientalis seed

由图2可知，随着提取时间的延长，侧柏籽油提取率不断提高，当处理时间在20～40min之间时，提取率增加较快；当处理时间超过40min时，提取率基本不变。这可能是由于在提取过程开始时，提取液与物料中油脂浓度差很大，扩散驱动力大；随着处理时间的延长，溶液体系的渗透压达到了动态平衡，出油率也基本保持恒定[4-5]。综合考虑，选择提取时间为40min较适宜。

2.2.3 超声波功率对侧柏籽油提取率的影响

在液料比8:1(mL/g)，提取时间20min，提取温度45℃条件下，不同超声波功率对侧柏籽油提取率的影响如图3所示。

图3 超声波功率对提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasound power on the yield of oil from Biota orientalis seed

由图3可知，随着超声波功率增加，侧柏籽油提取率逐渐增大，在超声波功率250W时达最高，然后随着超声功率的升高而略有下降。这可能是因为随超声波功率增大，空化作用和机械作用越强烈，分子扩散速度也就越大，油脂渗出就越快；当超声功率过大时，热效应导致油脂分解或挥发，使提取率略有减少[7]。故选取超声波功率为250W较适宜。

2.2.4 提取温度对油提取率的影响

在液料比8:1(mL/g)，超声波频率250W，提取时间20min条件下，不同提取温度对侧柏籽油提取率的影响如图4所示。

图4 提取温度对提取率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on the yield of oil from Biota orientalis seed

由图4可知，在较低温度时，随着提取温度的升高，侧柏籽油提取率有较大幅度地增加，提取温度50℃时，提取率达到最大值，继续提高提取温度，提取率基本保持不变。综合考虑，选取提取温度50℃较适宜。

2.3 中心组合设计试验及响应面法优化提取工艺

2.3.1 模型的建立与显著性检验

在单因素试验基础上，根据中心组合试验设计原理，选取液料比(X1)、提取温度(X2)、提取时间(X3)和超声波功率(X4)作为考察变量，以侧柏籽油提取率(Y)为响应值，设计4因素5水平试验，试验因素水平见表1，结果见表2。

表1 CCD中心组合试验因素水平Table 1 Variables and levels in central composite design

利用SAS8.1软件对表2中结果进行回归拟合分析，可以得到侧柏籽油提取率与超声波处理各因素的二次多元回归模型：

Y=93.27857-0.42625X1+0.777083X2+0.187917X3+ 0.32875X4-0.318705X12-0.133125X1X3-0.133125X1X4-0.462455X22-0.231875X2X3-0.728705X32-0.442455X42

表2 CCD试验设计结果Table 2 Results of central composite design

表3 回归统计分析表Table 3 ANOVA for the regression response surface model

对该模型进行方差分析，结果见表3。从表3可看出，模型回归极显著(P＜0.01)，即除X3X4项外，各变量因素对侧柏籽油提取率的影响在该模型中都达到了显著水平，回归决定系数R2=0.9988，说明响应值的变化有99.88%来源于所选因素的变化，模型修正决定系数R2Adj=0.9977，说明该模型能解释99.77%响应值的变化，失拟项不显著(P＞0.05)，可知回归方程拟合度很好，故可用此模型对超声波辅助提取侧柏籽油工艺条件的实验结果进行分析和预测。

2.3.2 响应面分析及优化

通过SAS8.1软件分析，得到下面的响应面及等高线图，见图5～10所示，考察拟合响应曲面的形状，分析液料比、超声波功率、提取时间和提取温度对侧柏籽油提取率的影响。

比较图5～10并结合表3可知：所选因素对响应值影响强弱次序为：提取温度＞液料比＞超声功率＞提取时间；图7和图8的等高线图呈明显的椭圆状，说明对应两因素之间的交互作用显著，图9和图10的等高线图呈一定的椭圆状，说明对应的两因素之间存在一定交互作用，但交互作用并不显著。为确定最佳响应值的因素水平组合，对回归方程求一阶偏导并令其为0，整理得到方程组，方程组的解即因素对应的代码值。根据代码值转化可得最佳理论工艺条件为：液料比7.21442:1 (mL/g)、提取时间37.585min、超声功率274.4845W，提取温度54.50358℃。在此最佳理论工艺条件下，侧柏籽油提取率的理论预测值为93.78%。考虑实际操作性，将提取工艺参数修正为：液料比7:1(mL/g)、提取时间38min、超声波功率270W，提取温度55℃。

图5 Y=f(X2,X3)的响应面和等高线图Fig.5 Response surface and contour plot showing the effects of extraction time and ultrasound power on the yield of oil from Biota orientalis seed

图6 Y=f(X1,X3)的响应面和等高线图Fig.6 Response surface and contour plot showing the effects of liquidto-solid ratio and ultrasound power on the yield of oil from Biota orientalis seed

图7 Y=f(X1,X4)的响应面和等高线图Fig.7 Response surface and contour plot showing the effects of liquidto-solid ratio and extraction temperature on the yield of oil from Biota orientalis seed

图8 Y=f(X3,X4)的响应面和等高线图Fig.8 Response surface and contour plot showing the effects of ultrasound power and extraction temperature on the yield of oil from Biota orientalis seed

图9 Y=f(X1,X2)的响应面和等高线图Fig.9 Response surface and contour plot showing the effects of liquidto-solid ratio and extraction time on the yield of oil from Biota orientalis seed

2.3.3 验证实验

对修正后的优化工艺参数进行3组验证性实验，结果分别为93.67%、93.34%、93.41%，平均值为93.47%，与理论预测值仅相差0.31%。因此，采用响应面分析法优化得到的工艺参数准确可靠，有较高的实用价值。

2.4 侧柏籽油的GC-MS分析结果

侧柏籽油经甲酯化处理后进行GC-MS分析，测定脂肪酸组成，利用NIST05标准谱库进行检索，并逐个解析各峰相应的质谱图，采用不做校正的峰面积归一法确定各组分的相对含量。侧柏籽油的脂肪酸甲酯GC-MS总离子流色谱图见图11，分析结果见表4。

图11 侧柏籽油脂肪酸甲酯总离子流色谱图Fig.11 Total ion current chromatogram of fatty acids from Biota orientalis seed oil

表4 侧柏籽油脂肪酸的组成及相对含量Table 4 Composition and relative content of fatty acids in Biota orientalis seed oil

由表4可知，侧柏籽油中主要含有肉豆寇酸、棕榈酸、亚油酸、油酸、亚麻酸、硬脂酸6种脂肪酸，其中不饱和脂肪酸含量为84.37%，以油酸、亚油酸和亚麻酸为主。

3 结 论

以环己烷为溶剂，采用超声波辅助技术提取侧柏籽油，通过单因素试验和中心组合设计(CCD)试验以及响应面分析对提取工艺参数进行优化，得出优化提取工艺条件为：液料比7:1(mL/g)、提取时间38min、超声波功率270W，提取温度55℃，在此工艺条件下，侧柏籽油提取率为93.47%。并得到超声波辅助提取侧柏籽油工艺条件的二次多元回归模型，该模型回归极显著，对实验拟合较好，有一定应用价值。

GC-MS分析结果表明，侧柏籽油中主要含有肉豆寇酸、棕榈酸、亚油酸、油酸、亚麻酸、硬脂酸等6种脂肪酸，其中不饱和脂肪酸含量高达为84.37%，以油酸、亚油酸和亚麻酸为主，具有一定的开发利用价值。

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Ultrasound-assisted Extraction and Fatty Acid Composition of Biota Orientalis Seed Oil

MA Cheng-jin1,2，WU Zhu-qing2，HUANG Wei2，XIAO Zhuo-bing1，HUANG Qun2
(1. Key Laboratory of Hunan Forest Products and Chemical Industry Engineering, Zhangjiajie 427000, China；2.Institute of Food Science, Jishou University, Jishou 416000, China)

Oil in Biota orientalis seed was extracted using n-hexane with the assistance of ultrasound. Effects of liquid-to-material ratio, extraction time, extraction temperature and ultrasound power on the yield of oil were investigated by conducting single factor tests. Subsequently, a central composite design was employed and the results were analyzed by using response surface methodology. The optimal extraction conditions were as follows: liquid-to-material ratio 7:1 , extraction time 38 min, extraction temperature 55 ℃,ultrasound power 270 W. Under such conditions, the yield of the oil was 93.47%. Gas chromatography-mass spectrometry analysis indicated that the oil was abundant in unsaturated fatty acids, accounting for 84.37% of the total fatty acids and consisting of 28.4.1% of oleic acid , 11.40% of linoleic acid and 44.56% of linolenic acid.

Biota orientalis seed oil；ultrasound-assisted extraction；technical conditions；response surface analysis；GC-MS

TS224.4

A

1002-6630(2010)24-0050-06

2010-08-30

2009年林产化工工程湖南省重点实验室开放基金项目(JDZ200902)

麻成金(1963—)，男，教授，硕士，研究方向为食物资源开发与利用。E-mail：machengjin368@126.com