毛细管电泳法对乳及乳制品中真蛋白的测定

丁晓静，杨媛媛，李 芸，赵 珊，王 志

(1.北京市疾病预防控制中心，北京 100013；2.首都医科大学公共卫生与家庭医学学院，北京 100069；3.河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071001)

毛细管电泳法对乳及乳制品中真蛋白的测定

丁晓静1,2，杨媛媛1,3，李 芸1,2，赵 珊1，王 志3

(1.北京市疾病预防控制中心，北京 100013；2.首都医科大学公共卫生与家庭医学学院，北京 100069；3.河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071001)

利用毛细管电泳法对市售乳清蛋白粉、采自当地奶牛场的牛初乳及原料奶、同一品牌不同阶段或同一阶段内不同厂家、不同国别的婴儿配方奶粉、不同保质期的液态奶、不同国别的超高温灭菌(UHT)奶和酸奶、国产复原乳中α-乳白蛋白(α-Lac)、β-乳球蛋白A (β-LgA)及β-乳球蛋白B (β-LgB)的质量分数进行测定。结果表明：α-Lac、β-LgA及β-LgB的质量分数在乳清蛋白粉、牛初乳及原料奶中依次降低。液态奶中上述3种蛋白的质量分数与保质期有关，一般保质期越久的产品，上述3种蛋白的质量分数越低。大多数酸奶中α-Lac的质量分数均高于UHT奶。婴儿配方奶粉中α-Lac质量分数随着阶段数的增加而增加，而且同一阶段内不同厂家不同国别配方奶粉中α-Lac质量分数差异也较大，并非进口奶粉中α-Lac质量分数均比国产奶粉高。

毛细管电泳；乳清蛋白粉；牛初乳；原料奶；婴儿配方奶粉；超高温灭菌奶；酸奶

乳及乳制品是人体获取蛋白质的主要来源之一，蛋白含量的高低已成为乳品质量的指标之一[1]。为了生产优质的乳品，发达国家十分重视乳品基础性研究，对乳品中蛋白检测非常重视并在技术上具有优势。我国虽已开展了相关工作，但相对薄弱且未形成系统，检测技术主要是凯氏定氮法和比色法[2]，这两种方法均是通过测定样品中的氮元素质量分数，乘以系数6.38来推算出样品中的总蛋白质量分数，但此法所测的氮元素有可能包括样品中的非蛋白氮，近几年发生的“大头娃娃”、“三聚氰胺”毒奶粉事件正是由于这两种方法

的局限性为不法分子掺加含氮有机物以提高蛋白质质量分数提供了可乘之机，严重侵害了消费者的利益，在很大程度上制约了我国乳业的良性发展。尽管新的国家标准能够测定乳品中非蛋白氮质量分数[3]，但仍不能直观地反映乳品中真蛋白的质量分数。因此，监测乳品中真蛋白质量分数变化，对生产过程中质量控制、提高产品档次、增强国有产品竞争力具有重要意义。

乳及乳制品中蛋白主要分为酪蛋白和乳清蛋白，其中酪蛋白约占总蛋白的80%，乳清蛋白约占15%。因为乳清蛋白是牛奶的主要成分之一，其含量的高低经常被用于评价乳品质量[4]。乳清蛋白是酪蛋白沉淀后清液中含有的蛋白[5]，主要由对热不稳定的α-乳白蛋白(α-Lac)、β-乳球蛋白(β-Lg)、免疫球蛋白(Ig)和牛血清白蛋白(BSA)组成。对热稳定性依下列顺序Ig＜BSA＜β-Lg＜α-Lac而增加[6-7]，即α-Lac对热较为稳定。其中α-Lac约占乳蛋白的3%、β-Lg约占9%、Ig占2%、BSA占1%，β-Lg又由β-LgA及β-LgB组成[8]。上述蛋白构成了乳中的“真蛋白”。目前世界上越来越多的国家如美国、法国、澳大利亚等开始采用真蛋白含量作为原料乳收购的计价因子，然而，由于该法依据的原理仍然是凯氏定氮法，因而可能会因不法分子掺加大豆水解蛋白等植物蛋白而失灵。国外又开发了快速检测真蛋白的方法，主要有红外光谱分析法、傅里叶转换红外线法及染料染色法等方法，但仅有一部分的乳品真蛋白快速检测方法被AOAC认可[1]。

毛细管电泳法(CE)因分离效率高，非常适合扩散系数小的蛋白质分析，已成功地用于保健食品中免疫球蛋白G的检测[9-10]，乳及乳制品成分分析和真蛋白定量测定[11-15]。十二烷基硫酸钠(SDS)-CE法已被作为国际标准(ISO、IDF)方法用于检测奶粉中是否掺入大豆或花生蛋白[16]。我国尚未用CE法对乳及乳制品中的α-Lac、β-LgA及β-LgB开展系统研究。因此，本研究利用CE技术分离测定乳及乳制品中α-Lac、β-LgA及β-LgB 3种蛋白[17]，通过乳清蛋白中质量分数较高的这3种蛋白质量分数变化的趋势，以期探索一种能够有效监测、控制乳及乳制品的产品质量，保护消费者的利益及健康的新途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试剂及电泳条件请详见文献[17]。乳清蛋白粉、婴儿配方奶粉、液态奶样品及酸奶样品均购于当地超市，牛初乳及原料奶均采自当地奶牛场。所有样品均平行测定两次。

1.2 仪器与设备

Beckman P/ACE 5000型毛细管电泳仪(配有紫外检测器和P/ACE工作站) 美国Beckman公司；F-33 pH/mV型酸度计 北京屹源电子仪器科技公司；Universal 32型离心机 德国Hettich公司；Millipore Milli-Elix/RiOs型超纯水器 美国Millipore公司；旋涡混合器 法国Gilson公司。

2 结果与分析

2.1 乳清蛋白粉的测定

称取0.5g样品置于50mL塑料离心管中，加入20mL 0.05mol/L HAc溶液(pH2.98)，涡旋混匀后于9000r/min离心10min，取上清液直接进样分析，所测样品通过加标来定性，以校正峰面积法定量(表1)。因为在CE分析中，迁移时间较长的组分，其峰面积将相应展宽而导致峰面积增加，为消除这一影响，一般将每个峰的峰面积除以各自的迁移时间即校正峰面积进行定量[18]。

表1 乳清蛋白粉中α-Lac、β-LgA、β-LgB测定结果Table1 Results ofα-Lac, β-LgA and β-LgB in whey protein powder

2.2 牛初乳、原料奶的测定

图1 牛初乳和原料奶的毛细管电泳图Fig.1 Electrophoregrams of bovine colostrum and raw milk

牛初乳是母牛生产后7d内产下的乳汁，具有极高

的营养价值。原料奶亦称生鲜奶，为初乳期过后采集的常奶。准确移取2mL牛初乳或原料奶于50mL塑料离心管中，加入18mL样品溶液，涡旋混匀后于9000r/min离心10min，取上清液进样。结果见表2，电泳图如图1所示。

表2 牛初乳和原料奶中α-Lac、β-LgA和β-LgB的测定结果Table2 Results ofα-Lac,β-LgA andβ-LgB in bovine colostrum and raw milk

由表2可以看出，牛初乳和原料奶中α-Lac、β-LgA及β-LgB质量分数均较高，一般情况下，β-乳球蛋白(β-Lg)的两个遗传变异体β-LgA和β-LgB总是同时存在，但在本实验所测的1#初乳样品中却不含β-LgB，5#初乳样品中不含β-LgA，这两种极端情况与Kim等[19]报道的情况相一致，极端情况与β-LgA及β-LgB的等位基因有关。

2.3 不同保质期牛奶样品的测定

表3 不同保质期牛奶样品中α-Lac、β-LgA和β-LgB的测定结果Table3 Results ofα-Lac,β-LgA andβ-LgB in milk of different shelf-life

从市场选取国产同一品牌、不同保质期的牛奶样品进行测定。准确移取2mL牛奶样品于15mL塑料离心管中，加入3mL样品溶液，涡旋混匀后于9000r/min离心10min，取上清液进样。结果见表3，电泳图见图2。保质期为3d和7d的产品为巴氏杀菌奶，3种蛋白的质量分数最高，蛋白被破坏程度小，而保质期为30、50、180d和240d的产品均为UHT奶，3种蛋白的质量分数显著下降，β-LgA和β-LgB已经无法检出，其中α-Lac质量分数差别不大，保质期为30d的牛奶的电泳图不同于保质期为240d的牛奶的电泳图，从图2中很容易辨别是巴氏杀菌奶还是超高温灭菌奶。

图2 不同保质期的牛奶样品及6#样品加100mg/L 3种蛋白混标电泳图Fig.2 Electrophoregrams of milk of different shelf-life and sample 6#spiked with 100 mg/L of three mixed protein standards

2.4 不同国别、不同厂家UHT奶的测定

表4 进口、国产UHT奶中α-Lac的测定Table4 Content ofα-Lac in UHT milk from imported and domestic products

从当地超市购买不同国家生产的UHT奶，为便于比较，对每一国家生产的UHT奶均采集同一厂家但不

同口味的产品，按2.3节方法处理样品进行测定。结果如表4所示，同一厂家但不同口味的产品中α-Lac质量分数存在一定差异；无论是进口还是国产UHT奶，其中α-Lac质量分数有一定差异，可能与生产工艺或原料奶来源有关。

2.5 复原乳样品的测定

由于当前市场上标识有复原乳的样品较少，将采自当地超市国内某厂家的5个标识为复原乳、保质期均为15个月的样品，按2.3节方法处理样品进行测定。由于复原乳至少经过二次受热，其中α-Lac的质量分数显著下降，仅在盒装的复原乳中检测到α-Lac质量分数为13.6mg/100g，其余4种罐装复原乳样品中α-Lac质量分数低于定量限，无法准确定量。这两种包装的产品中α-Lac质量分数差异或许与加工工艺有关。另外，复原乳中α-Lac的质量分数显著低于国产UHT奶，或许通过这种途径很容易判断所谓的鲜奶是否为复原乳。

2.6 酸奶样品的测定

准确称取2g酸奶样品于15mL塑料离心管中，加入3mL样品溶液，涡旋混匀后于9000r/min离心10min，取上清液进样。分别测定不同国家、不同厂家的酸奶样品，检测发现酸奶样品中不含易致敏的β-lgA及β-lgB，仅含α-Lac，这也证明对牛奶过敏的人喝酸奶则不易过敏。测定结果见表5。

表5 不同国别、不同厂家酸奶样品中α-Lac测定Table5 Content ofα-Lac in yogurt from different countries and plants

由表5可知，酸奶样品中的α-Lac质量分数比UHT牛奶样品中的质量分数普遍偏高，进口样品中α-Lac的质量分数大多高于国产样品，西班牙样品的保质期达270d，其中α-Lac质量分数比国产奶制品保质时间只有20d左右的样品质量分数还要高，澳大利亚的5#样品中质量分数高达97mg/100g，与原料奶中的质量分数相差不大，说明在产品加工过程中蛋白损失少。但并非所有的酸奶样品α-Lac质量分数均高，如国产中的16#样品，其质量分数低于方法的定量限，无法准确定量。2.7不同阶段配方奶粉中α-Lac的测定

母乳中含有丰富的α-Lac且不含β-LgA及β-LgB，Lucla等[20]采用反相高效液相色谱法测定不同人群不同哺乳期的母乳中α-Lac质量浓度，其测定值在160～825mg/ 100mL范围内，因此，α-Lac经常被添加到婴儿配方奶粉中以提高奶粉的母乳化程度，同时除去其中婴幼儿不耐受的β-lgA及β-lgB。此外还添加了利于婴儿健康成长的营养成分，这些添加的组分干扰β-LgA及β-LgB的准确测定，因而用文献[17]方法只能测定奶粉中α-Lac的质量分数。准确称取0.5g样品于15mL塑料离心管中，加入5mL样品溶液，涡旋混匀后于9000r/min离心10min，取上清液进样。从市场上采购的1#、2#和3#三个品牌的Ⅰ段(婴儿配方奶粉)、Ⅱ段(较大婴儿配方奶粉)和Ⅲ段(幼儿配方奶粉)奶粉中α-Lac质量分数值见表6，电泳图见图3～5。

表6 不同阶段奶粉中α-Lac的测定Table6 Content ofα-Lac in infant formula of different age stages

图3 1#样品3个阶段及Ⅲ段加标电泳图Fig.3 Electrophoregrams of three age stages of sample 1#and age stage III spiked with three mixed proteins

图4 2#样品3个阶段及Ⅲ段加标电泳图Fig.4 Electrophoregrams of three age stages of sample 2#and age stage III spiked with three mixed proteins

图5 3#样品3个阶段电泳图Fig.5 Electrophoregrams of three age stages of sample 3#

表6结果表明：同一阶段内的不同样品中α-Lac的质量分数不同，存在较大差异。不同阶段的配方奶粉具有不同的α-Lac质量分数，而且随着阶段数的增加，α-Lac质量分数呈上升趋势，这种质量分数变化应该与婴幼儿的成长需要相关。

2.8 同一阶段内国产与进口奶粉的比较

表7 同一阶段国产与进口奶粉中α-Lac测定Table7 Content ofα-Lac in infant formula from domestic and imported products with the same age stage

表7表示同一阶段内，不同国别、不同厂家的奶粉中α-Lac质量分数。通过同一阶段内国产奶粉与进口奶粉的比较，发现并不是所有进口奶粉的α-Lac质量分数都比国产奶粉高，如进口奶粉中的6#、13#、19#等样品，其α-Lac质量分数只有21、43、19mg/100g，此值远远低于其他奶粉的质量分数水平，而某些国产奶粉的α-Lac质量分数与进口奶粉相当，甚至高于进口奶粉，如国产奶粉的3#、4#、9#、14#等样品，其α-Lac质量分数分别为167、212、234、310mg/100g。

3 结 论

无论是牛初乳，还是原料奶，其中的α-Lac、β-LgA及β-LgB三种蛋白的质量分数均高于市售巴氏杀菌奶和UHT奶，证明巴氏或UHT杀菌加工过程中，能降低原料奶中α-Lac、β-LgA及β-LgB三种蛋白的质量分数。α-Lac的质量分数依原料奶、巴氏乳及UHT奶的顺序而依次降低，与涂层毛细管的实验结果相一致[21]。随着CE技术的不断完善和发展，因其较适合蛋白分析且绿色、环保，在乳及乳制品中真蛋白分析中将会发挥越来越重要的作用。

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Use of Capillary Electrophoresis for Determination of Genuine Proteins in Milk and Milk Products

DING Xiao-jing1,2，YANG Yuan-yuan1,3，LI Yun1,2，ZHAO Shan1，WANG Zhi3
(1. Beijing Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100013, China；2. School of Public Health and Family Medicine, Capital Medical University, Beijing 100069, China；3. College of Food Science and Technology, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China)

The contents of theα-lactalbumin (α-Lac), β-lactoglobulin A (β-LgA) and β-lactoglobulin B (β-LgB) were determined by capillary electrophoresis in whey protein powder, bovine colostrum and raw milk from the local farm, infant formula of the same brand but for different age stages or of the same age stages from different plants and countries, liquid milk with different shelf-life, ultra-high temperature (UHT) milk and yogurt from different countries and domestic reconstituted milk. The contents of the above three proteins decreased in the order of whey protein powder, bovine colostrum and raw milk, and were negatively related to the shelf-life of milk and milk products. The content of α-Lac in most of the yogurts were higher than that in UHT milk. The contents of the α-Lac in infant formula increased with the age stage. Infant formula with the same age stages of different brands and countries had significant differences in the contents of α-Lac. The contents of α-Lac in imported formula were not always higher than those from domestic ones. The results provide a valuable asset for the analysis of true proteins in milk and milk products.

capillary electrophoresis；whey protein powder；bovine colostrum；raw milk；infant formula；ultrahigh temperature (UHT) milk；yogurt

O657.8

A

1002-6630(2010)22-0361-06

2010-03-05

北京市“十百千”卫生人才培养项目

丁晓静(1968—)，女，副主任技师，博士，研究方向为食品卫生理化检验。E-mail：dingxiaojing@gmail.com