白果蛋白质提取及SDS-PAGE分析

李莹莹，吴彩娥,*，杨剑婷，贾韶千，徐文斌，彭方仁

(1.南京林业大学森林资源与环境学院，江苏 南京 210037；2.安徽科技学院食品药品学院，安徽 凤阳 233100)

白果蛋白质提取及SDS-PAGE分析

李莹莹1，吴彩娥1,*，杨剑婷2，贾韶千1，徐文斌1，彭方仁1

(1.南京林业大学森林资源与环境学院，江苏 南京 210037；2.安徽科技学院食品药品学院，安徽 凤阳 233100)

以白果为原料，采用不同的原料处理及蛋白质提取方法，运用单因素和正交设计的方法，以料液比、提取时间、提取液浓度、提取液pH值为考察因素，研究白果蛋白质提取的最佳工艺条件，并对提取的白果蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。结果表明：经过冷冻干燥处理的白果采用Tris-HCl提取法获得的白果蛋白含量较高；Tris-HCl法提取白果蛋白的最佳工艺为pH8.5、0.15mol/L Tris-HCl溶液、料液比1:20(g/mL)、提取时间4h，白果蛋白质的提取率达到75.01%。白果蛋白SDS-PAGE分析表明，白果蛋白中约含13条亚基，主要为21kD和32kD的两种亚基，白果蛋白的亚基主要集中在31～100kD，占亚基总数的77%。

白果；蛋白质；提取；SDS-PAGE

银杏为裸子植物门银杏纲银杏植物(Gingko biloba L.)，为一科一属一种的特殊植物，是我国特有的古老珍贵树种之一[1]。银杏种实去掉肉质外种皮后的种核部分俗称白果。白果富含淀粉、蛋白质和脂肪等营养物质，以及银杏酸、白果酚、五碳多糖、胆固醇等功能成分[2]，自古以来被当作养生延年的上品，而现代已成为传统的出口产品。初步研究显示，白果具有高效广谱杀菌作用和耐缺氧、抗疲劳、延缓衰老等保健治疗功效[3]。白果中含有8.7%～13.4%的蛋白质(不同品种有差异)，其氨基酸组成丰富、合理，属于优质蛋白，有研究显示，白果药食兼备的特性及其保健功能与其蛋白质成分有着紧密联系，但现今对白果蛋白质的研究较少，且尚处于初始阶段。Jensen等[4]在1989年从白果中分离出一种类似豆球蛋白的物质。黄文等[5]在2004年采用盐溶法提取白果中的蛋白质，并进行了抗生物氧化动物实验，表明白果蛋白具有体外抗氧化作用和抗生物氧化的作用。除此之外，杨剑婷等[6]研究认为白果中的贮藏蛋白可能具有致敏性，从而影响白果的加工利用，可见对白果蛋白质的研究，对白果的有效利用有着重要的意义。

SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)在蛋白质的量化、比较及特性鉴定中是一种经济、快速、重复性好的方法。本实验以白果为原料，对白果

蛋白质的提取方法及工艺条件进行研究，并运用SDSPAGE法对白果蛋白进行分析，在此基础上建立适宜白果蛋白提取和SDS-PAGE的一套方法，以期为白果的品种纯度检测和加工利用等研究提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白果：品种为泰兴大佛指，购自江苏泰兴市。白果去掉外种皮后于0～4℃贮藏。

SDS-PAGE凝胶电泳所用试剂 Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

TU-1800PC紫外分光光度计 北京普析通用容器有限责任公司；DYY-6C型电泳仪 北京六一仪器厂；电泳自动成像仪 美国BIO-RAD生化科技有限公司；PHS-2C型数显pH计 上海智光仪器仪表有限公司；GL-20GII型冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.3 原料处理及蛋白质提取

1.3.1 原料处理

冻干处理：新鲜白果于－20℃真空冷冻干燥，研磨过筛，石油醚脱脂；烘干处理：新鲜白果于30℃烘箱中烘烤12h，研磨过筛，石油醚脱脂；对照：去掉外种皮后于0～4℃贮藏的白果。

1.3.2 白果蛋白质提取

1.3.2.1 Tris-HCl法

参照谷瑞升等[7]的方法。取脱脂后3种样品各1g，加入10mL的0.2mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，4℃浸提6h后于4℃、4000r/min离心15min，取上清液测定蛋白质含量。

1.3.2.2 盐溶法

参照黄文等[5]的方法。取脱脂后3种样品各1g，加入10mL的0.14mol/L NaCl溶液，4℃浸提6h后在4℃、4000r/min离心15min，取上清液测定蛋白质含量。

1.3.2.3 磷酸缓冲液提取法

取脱脂后3种样品各1g，加入10mL的0.05mol/L pH8.0磷酸缓冲液(含0.1mol/L KCl、2mmol/L EDTA)，4℃浸提6h后4℃、4000r/min离心15min，取上清液测定蛋白质含量。

1.3.2.4 三氯乙酸(TCA)-丙酮提取法

参照Damerval等[8]的方法。取脱脂后3种样品各1g，加入预冷的2mL三氯乙酸(TCA)-丙酮溶液(含体积分数10% TCA、0.07%β-巯基乙醇)，充分混匀后，在－20℃静置1h，4℃、15000r/min条件下离心15min。离心后去掉上清液，保留的沉淀用预冷的丙酮(－20℃，含0.07%β-巯基乙醇)悬浮，在－20℃冰箱内浸提过夜。次日，在4℃、15000r/min条件下离心10min，去上提液，留沉淀，再加入经预冷的丙酮进行浸提，1h后相同条件离心，弃上清液，收集沉淀。沉淀在30℃恒温烘箱中烘干。取干粉，按1:10(g/mL)加入蒸馏水溶解，溶解后以4000r/min离心15 min，取上清液测定蛋白质含量。

1.4 白果蛋白质提取工艺的确定

1.4.1 单因素试验

在其他条件一定时，提取液浓度采用0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mol/L Tris-HCl 5个水平，提取液pH值采用6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0 Tris-HCl(0.2mol/L) 6个水平，料液比采用1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30(g/mL)6个水平，提取时间采用2、4、6、8、10h 5个水平，分别进行单因素试验。

1.4.2 正交试验设计

根据单因素试验结果，选择提取液浓度、提取液pH值、料液比、提取时间进行四因素四水平L16(45)正交试验设计。

1.5 蛋白质的测定

可溶性蛋白含量应用Bradford法[9]，牛血清蛋白为标准蛋白，考马斯亮蓝G250染色，做标准曲线方程为Y=8.2134X+0.0214，R2=0.9985。

提取材料中蛋白质含量：微量凯氏定氮法[10]。

1.6 SDS-PAGE凝胶电泳

采用电泳仪进行不连续双垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳。将白果蛋白提取液与样品缓冲液(pH6.8、0.5mol/L Tris-HCl缓冲液2.0mL、无水丙三醇2.0mL、20% SDS 2.0mL、质量分数0.1%溴酚蓝0.5mL、β-巯基乙醇1.0mL、去离子水2.5mL)按1:1的体积比例混合，100℃煮沸5min，离心，上样20μL，分离胶质量浓度12mg/100mL，浓缩胶质量浓度3.9mg/100mL。开始电流10mA，进入分离胶后20mA，电泳时间2.5～3.5h。考马斯亮蓝R-250染色，过夜，放入脱色液中脱色，直至胶片背景蓝色完全透明状，电泳自动成像仪拍照，蛋白质分子质量运用Quality one软件进行分析。

1.7 数据分析

数据采用DPS(Version 3.01)统计软件进行统计分析，设置显著水平分别为P＜0.05及P＜0.01。所有实验设3次重复，结果均为平均值，以“平均值±标准误”表示，并进行方差分析和Duncan检验。

2 结果与分析

2.1 原料处理及蛋白质提取方法的确定

对于不同处理的白果用4种提取方法获得的白果蛋白质的含量，如图1所示。原料白果中总蛋白含量经凯氏定氮法测定为10.82g/100g干质量。由图1可知，对于冻干处理的白果原料，4种提取方法得到的白果蛋白质的含量相差较大，以Tris-HCl法得到的蛋白质的含量最高，达到5.82mg/mL，其次是TCA-丙酮提取法、磷酸缓冲液提取法、盐溶法。经多重比较，4种提取方法得到的蛋白质含量之间差异达到极显著水平(P＜0.01)。对于新鲜白果及烘干处理的白果，Tris-HCl法得到的蛋白质的含量也略高于其他3种提取液，且差异显著(P＜0.05)。所以本实验采用Tris-HCl法为白果蛋白的提取方法。从图1可以看出，对于Tris-HCl法提取的3种处理白果的蛋白质含量，经多重比较，冻干处理的白果经过提取获得的蛋白质的含量显著高于烘干处理及新鲜白果(P＜0.01)，可能原因是冷冻干燥在低温、低压下进行，物料的干燥在冻结状态下完成，与其他干燥方法相比，物料的物理结构和分子结构变化极小，且其内部形成多孔的海绵状[11]，有利于蛋白质的溶出。

图1 原料处理方式及不同提取方法对白果蛋白质的含量的影响Fig.1 Effects of material pretreatment ways and extraction solvents on protein extraction from Ginkgo biloba seeds

2.2 单因素试验

2.2.1 提取液浓度对提取率的影响

图2 提取液浓度对白果蛋白质提取率的影响Fig.2 Effect of Tris-HCl concentration on protein extraction from Ginkgo biloba seeds

由图2可见，在Tris-HCl浓度为0.05～0.15mol/L的范围内，随着Tris-HCl浓度的提高，蛋白质提取率不断升高，当Tris-HCl浓度为0.15白果蛋白质的提取率达到最高。当提取液浓度再逐渐增加时，蛋白质提取率不断下降。可能是浓度进一步提高时，离子的水合作用，降低了蛋白质的溶解度[12]，从提高蛋白质提取率及节约溶质用量两方面考虑，选择0.15mol/L的Tris-HCl溶液为白果蛋白质的提取液。

2.2.2 提取液pH值对提取率的影响

当提取液pH值由6.5逐步升高到9.0时，白果蛋白质提取率随pH值的增高增大(图3)，此规律在pH值7.0～8.5之间更为明显。但当pH值继续增加时，提取率增加减慢，这是由于碱可以使白果的结构变疏松，还会打破蛋白质分子间的部分氢键[13]，从而促使淀粉和蛋白质分离，增加了蛋白提取率。但是，过强的碱性环境，会使蛋白质变性和水解，增加美拉德反应程度，使蛋白质颜色变黑，商用品质降低；强碱还易引起赖氨酸等发生交联，产生有毒物质，所以，提取白果蛋白质的提取液pH值应控制在8.5左右。

图3 提取液pH值对白果蛋白质提取率的影响Fig.3 Effect of extraction pH on protein extraction from Ginkgo biloba seeds

2.2.3 料液比对提取率的影响

图4 料液比对白果蛋白质提取率的影响Fig.4 Effect of material/liquid ratio on protein extraction from Ginkgo biloba seeds

随着溶液体积的增大，原料与提取液接触面的增大，蛋白质越容易渗透到提取液中，提取率相应增大[14]。从图4看出，当提取液的料液比在1:10～1:20(g/mL)

之间时，白果蛋白质的提取率不断升高，料液比达到1:20(g/mL)时提取率最高，之后，提取率基本趋于稳定，略有下降，考虑到食品工业生产过程中，溶液体积太大会增加水分和溶剂的用量，也增大后续干燥处理的负担，提高了产品成本，故认为选取料液比1:20(g/mL)进行提取比较适宜。

2.2.4 提取时间对提取率的影响

图5 提取时间对白果蛋白质提取率的影响Fig.5 Effect of extraction time on protein extraction from Ginkgo biloba seeds

从图5可看出，提取时间在4h时，蛋白质提取率较高，其后随着提取时间的进一步增加，蛋白质提取率下降，但下降幅度不大，在4h到10h的区间内，提取率从58.6%下降到54.2%，下降比率为7.3%，可能的原因是白果粉本身需要一定的溶胀时间，充足的溶胀时间利于蛋白质的分离溶解[15]，但若提取时间过长，则可能有部分蛋白质出现凝聚沉淀，与不溶物质一起在离心时除去了，而且时间加长也会加大生产成本，所以综合各方面因素，认为浸提时间选4～6h比较合适。

2.3 白果蛋白质提取条件优化

表1 正交试验设计及结果Table1 Orthogonal array design arrangement and experimental results

在单因素试验基础上做正交试验，优化提取工艺。正交试验结果见表1。

选取料液比(A)、提取时间(B)提取液浓度(C)、提取液pH值(D)4个因素，以白果蛋白质的提取率为指标，优化出白果蛋白质的最佳提取条件，从试验结果(表1)可以得出：影响白果蛋白质子蛋白质提取率的因素显著(R值)次序为A＞C＞D＞B，即料液比对白果蛋白质的提取率影响最大。极差分析表明白果蛋白质的最佳提取条件应为A3B2C2D4，即料液比1:20(g/mL)、提取时间4h、pH8.5、0.15mol/L的Tris-HCl为白果蛋白的提取条件为最优组合。本研究以此条件作验证实验，得到样品蛋白质提取率为75.01%。正交试验中组合A3B1C3D4的蛋白质提取率为最大值为70.90%。因此，pH8.5、0.15mol/L的Tris-HCl溶液作为提取液、料液比1:20(g/mL)、提取时间4h为白果蛋白质的最佳提取条件。所得白果蛋白质提取率可达到75.01%。

表2 正交试验结果方差分析表Table2 Variance analysis for protein yield with various extraction conditions

表2方差分析结果表明：料液比为影响白果蛋白质提取过程的显著因素，提取时间、提取液浓度、提取液pH值为不显著因素。

2.4 白果蛋白质亚基分布及其分子质量

图6 白果蛋白的SDS-PAGE图Fig.6 SDS-PAGE of proteins from Ginkgo biloba seeds

对白果蛋白提取液进行SDS-PAGE凝胶电泳，白果蛋白的亚基分布见图6，染色后白果蛋白质条带清晰可见，染色程度越深，说明含量越高，反之越低[16]。从白果蛋白的SDS-PAGE图及其亚基分布谱图可以看出，白果蛋白所含亚基数约为13条，亚基的分子质量范围为

10～100kD，其中，白果蛋白亚基的最大分子质量为99.2kD，最小的为13.1kD；亚基10、亚基11含量最高，其次为亚基7、亚基9及亚基12。白果蛋白的亚基主要集中在31～100kD之间，占亚基总数的77%，其余亚基集中在13～22kD的范围内，可见白果蛋白多以大分子的结构存在。综上所述，白果蛋白经SDS-PAGE分析后得到了很好的分离效果，蛋白质带表现出了良好的多态性。白果中蛋白种类丰富，主要存在分子质量为21kD和32kD的两种亚基，十余种含量略低的其他蛋白亚基，大分子亚基较多。

3 结 论

经过冷冻干燥处理的白果采用Tris-HCl提取法获得的白果蛋白含量较高，显著优于其他处理。通过单因素及正交试验，经方差分析可知在本试验范围内，各因素对白果蛋白质提取率作用大小依次为：料液比＞提取液浓度>提取液pH＞提取时间。Tris-HCl法提取白果蛋白的最佳工艺为pH8.5、0.15mol/L Tris-HCl溶液、料液比1:20(g/mL)、提取时间4h，白果蛋白质的提取率达到75.01%。采用Tris-HCl提取法提取的白果蛋白经SDSPAGE分析，得到了很好的分离效果，条带清楚，背景清晰。Tris-HCl提取法适于白果蛋白的SDS-PACE分析。白果蛋白中约含13条亚基，主要为21kD和32kD的两种亚基，白果蛋白的亚基主要集中在31～100kD之间，占亚基总数的77%。

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Extraction and SDS-PAGE Analysis of Proteins from Ginkgo biloba Seed

LI Ying-ying1，WU Cai-e1,*，YANG Jian-ting2，JIA Shao-qian1，XU Wen-bin1，PENG Fang-ren1
(1. College of Forest Resources and Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China；2. College of Food and Drug, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China)

A comparative investigation of the effects of material pretreatment ways and extraction solvents on protein extraction from Ginkgo biloba seeds was made, and based on the experimental results Tris-HCl as the optimal extraction solvent and lyophilization as the optimal material pretreatment way were selected for the subsequent investigations, including optimization of protein extraction from Ginkgo biloba seeds by single-factor and orthogonal array design methods and SDS-PAGE analysis of the proteins extracted from Ginkgo biloba seeds. The optimal conditions for extracting proteins from this material were determined to be: pH, 8.5; Tris-HCl concentration, 0.15 mol/L; material/liquid ratio, 1:20; and extraction duration, 4 h. A protein yield of 75.01% was obtained under the optimal extraction conditions. The SDS-PAGE analysis showed that the proteins from Ginkgo biloba seeds contained approximately 13 subunits (mainly 21 kD and 32 kD ones) and that majority of them had a molecular mass varying from 31 to 100 kD, with a relative content of 77%.

Ginkgo biloba seed；protein；extraction；SDS-PAGE

S664.3；TS201.2

A

1002-6630(2010)22-0036-05

2010-01-18

教育部博士点基金项目(200802980004；20070298008)；国家自然科学基金项目(30872055)

李莹莹(1984—)，女，硕士研究生，研究方向为经济植物资源加工利用及其安全控制。E-mail：njliyingying@yahoo.com.cn

*通信作者：吴彩娥(1963—)，女，教授，博士，研究方向为食品工程技术及食品活性物质分离纯化。E-mail：sxwucaie@163.com