津晋地区原料奶中微生物污染程度分析与鉴定

高文茹，陈庆森*，阎亚丽，庞广昌，胡志和

(天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134)

津晋地区原料奶中微生物污染程度分析与鉴定

高文茹，陈庆森*，阎亚丽，庞广昌，胡志和

(天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134)

沙门氏菌是一种重要的人畜共患肠道疾病致病菌，它引起的食物中毒已成为一类最常见且危害性较大的细菌性食物中毒。本研究对我国津晋地区原料奶中微生物污染情况进行分析与鉴定，主要包括菌落总数、大肠菌群和沙门氏菌的检测。结果显示：津晋地区原料奶来源不同，奶源质量有较大差别。菌落总数平均在104～107CFU/mL之间，存在许多超标奶；大肠菌群数差别较大，晋奶源质量很好，大肠菌群数均低于110MPN/mL，天津地区乳品厂A大肠菌群数最高为1100MPN/mL，乳品厂B受到大肠菌群的严重污染，几乎均大于或等于11000MPN/mL；沙门氏菌未检出。研究证实了津晋地区原料奶的质量和安全性不容忽视。

原料奶；微生物；菌落总数；大肠菌群；沙门氏菌；污染

原料奶质量的高低是影响奶制品质量的关键，只有优质的原料奶才能保证生产出优质的产品。如果原料奶的质量控制不当，很有可能在生产过程中或者加工后产品贮藏过程中出现严重的质量问题。大肠菌群和菌落总数是奶和奶制品的重要质量指标，它不仅可以反映成品的卫生质量和加工过程中的卫生情况，而且还可反映运输、加工和贮藏过程中的温度控制是否合理。因此，检测这两项指标对于乳品加工能起到一定的指导作用。

沙门氏菌为革兰氏阴性短杆菌，无荚膜、周生鞭毛、能运动、少数不运动，需氧或兼性厌氧菌。沙门氏菌属广泛存在于自然界中，它在水中能存活2～3周，粪便中可存活1～2个月，可在冰冻土壤中过冬，在牛乳及肉类中能存活数月。它是肠杆菌科中常见的一个重要的食源性病原菌属，是由一群形态、生物学特

性与血清学上相似或相关的细菌组成[1-3]。目前全世界已分离出2579个血清型，我国已发现至少322个以上的血清型[4]。与人类疾病有关的血清型主要集中于 A～E 群，其中以鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌及猪霍乱沙门氏菌最为常见。沙门氏菌引起食物中毒是全球性的，通常占细菌性食物中毒的前一、二位，其在我国多年来占首位[5]。沙门氏菌病是一种重要的人畜共患传染性疾病，国内外多有发生，由原料奶及奶制品所引起的沙门氏菌病在美国多见于报道[6-7]。沙门氏菌病有几种传播途径，但大多数人感染还是由于食用了被沙门氏菌所污染的动物性食物，其中禽肉及其他肉类产品是最主要的人源沙门氏菌感染源[8-9]。国外有报道原料奶中沙门氏菌检出的情况。Chyea等[10]分析了马来西亚半岛360个奶牛场的原料奶的微生物污染情况。其从南部、中部、北部和东部4个地区采集了930份奶样进行检测，几乎90%的奶样被大肠菌群所污染，仅有1.4%的奶样被沙门氏菌所污染。Cetinkaya等[11]分析了土耳其布尔萨省多种食品中沙门氏菌和志贺氏菌的污染情况。其从2004年12月至2005年7月在超市及小型售货摊上采集了416份食品样品，包括鸡肉、肉馅、即食的色拉酱，蔬菜以及原料奶，结果显示仅从鸡肉中分离出一株沙门氏菌，志贺氏菌未检出。Jayarao等[12]分析了因食用原料奶及奶制品而感染致病菌的风险，选取了美国宾夕法尼亚州16个县郡的248份样品，共6%的样品检出沙门氏菌。

沙门氏菌污染原料奶后，一般不会引起原料奶感官性状的变化，但在合适的条件下沙门氏菌产生的肠毒素会达到危险水平，足以危害消费者的健康。该毒素不被胰蛋白酶和其他水解蛋白酶所破坏，并对酸碱有抵抗力，因此会严重影响原料奶的质量，由其制成的奶制品会引起食物中毒，对消费者的安全造成极大影响。因此，从原料奶及奶制品质量与安全的角度出发，很有必要对我国原料奶中沙门氏菌的检出率、分布情况和血清型进行分析鉴定，以确定污染源、污染途径，制订相应的检测标准和卫生安全标准，提供消毒和杀菌的指导，并为应对可能出现的突发食物中毒事件提供参考依据。

本研究采用最新国标中规定的方法对天津和山西两个地区的原料奶进行了菌落总数、大肠菌群数及沙门氏菌的检测和鉴定。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

营养琼脂、平板计数琼脂培养基(PCA)、月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤、煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤、缓冲蛋白胨水培养基、四硫磺酸钠煌绿(TTB)培养基、亚硒酸盐胱氨酸(SC)培养基、亚硫酸铋(BS)琼脂、木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂、三糖铁(TSI)琼脂、赖氨酸脱羧酶肉汤、氨基酸脱羧酶对照、尿素酶、色氨酸肉汤、氰化钾、氰化钾对照、卫矛醇半固体、甘露醇发酵管、ONPG、山梨醇发酵管、丙二酸盐、水杨苷发酵管 青岛海博生物有限公司。

培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；NiKon ECLIPSE E200显微镜；冰箱；恒温水浴锅。

1.2 方法

1.2.1 原料奶取样方法

在津晋地区选取3个有代表性的中型生产规模以上的乳品厂。其中天津选取两个乳品厂，山西选取一个乳品厂。每个乳品厂选10个奶牛场或送奶户，不足10个奶牛场的乳品厂选取其全部奶牛场进行取样，用进样器取12mL于无菌的15mL离心管中，做好标记。每个奶场(户)取3个平行，放入盛有冰块的真空保温壶中让其迅速冷却，用作卫生指标和沙门氏菌的分析鉴定。

1.2.2 菌落总数的测定

参见GB/T 4789.2—2008《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》[13]。

1.2.3 大肠菌群数的测定

参见GB/T 4789.3—2008《食品卫生微生物学检验大肠菌群计数》[14]。

1.2.4 沙门氏菌的检验

参见GB/T 4789.4—2008《食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验》[15]。

1.2.5 数据处理

使用Excel 2003软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 原料奶样品中细菌总数的测定及分析

对取自天津、山西地区的原料奶进行细菌总数的检测，检测结果如表1所示。

菌落总数是判定食品被污染程度的标志，它能反应微生物在食品中的繁殖动态[16]。食品中细菌数量越多，说明食品被污染的程度越重、越不新鲜、对人体健康威胁越大。中国对原料奶的微生物标准相对比较宽松，只将牛乳分为4个等级[17]：Ⅰ级细菌数为5×105个/mL；Ⅱ级为1×106个/mL；Ⅲ级2×106个/mL；Ⅳ级4× 106个/mL。自2001年起我国颁布的NY 5045—2001《无公害食品 生鲜牛乳》[18]中规定原料奶中菌落总数不得超过50万个，至2008年最新颁布的替代NY 5045—2001的农业行业标准[19]中仍沿用此微生物限值，可见原料奶中微生物控制标准有所提高，但与发达国家相比还有很大差距，指标为5×105个/mL的原料奶在很多国家都不能作为液体奶的原料。

表1 我国津晋地区原料奶样品的菌落总数的检测结果Table 1 Total bacterial count in raw milk from Tianjin and Shanxi regions

从表1可以看出，天津地区乳品厂A原料奶质量相对较高，合格率达到60%，少数为超标奶。乳品厂B原料奶几乎全部为超标奶，可能与采奶时间有关，分析原因可能采奶时间为夏季，此季节温度较高，比较有利于微生物的繁殖。而且，乳品厂A比乳品厂B的生产规模大，奶源多为固定牧场提供，乳品厂B散奶户较多，相对奶源质量较参差不齐。山西地区奶源质量较高，合格率也达到70%，且50%的奶样菌落总数数量级仅为104，能达到国外标准，但仍存在部分超标奶，需要引起重视。

2.2 原料奶中大肠菌群数的测定

对3个地区的原料奶进行大肠菌群的检验，结果见表2。

表2 我国津晋地区原料奶样品中大肠菌群检出情况Table 2 Coliforms bacterial count in raw milk from Tianjin and Shanxi regions

大肠菌群是一种在37℃条件下能发酵乳糖产酸产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，来源于人体和温血动物的粪便，它包括埃希氏菌属(大肠杆菌)、肺炎克雷伯菌属、柠檬酸杆菌属和肠杆菌属[20-21]。食品中大肠菌群的污染可用来判定食品被粪便污染程度，间接推断食品中有无污染肠道致病菌(如志贺氏菌、沙门氏菌等)的可能[22]。目前，我国还没有关于原料奶中大肠菌群数的控制标准，强制性国家标准GB 2746—1999《酸牛乳》[23]和GB 19302—2003《酸乳卫生标准》[24]中规定，酸牛乳中大肠菌群数应小于或等于90MPN/100mL。从表2来看，山西地区原料奶直接或间接受粪便污染程度较小，最高大肠菌群数为110MPN/mL。天津地区受粪便污染程度差异较大，从15MPN/mL到大于11000MPN/mL。

总体来看山西地区原料奶质量要优于天津地区。这可能与其生产环境、加工人员、储存运输等因素有关。综合分析可知，从天津和山西两地区的自然环境和人文环境看，虽然天津地区自然环境比山西地区要好，但据取样时的条件和乳品加工规模分析，山西地区的奶牛饲养区的卫生情况较好，挤奶过程卫生质量规范，天津地区取样的乳品厂A生产规模较大，奶源大多为固定牧场提供，质量控制较好；而乳品厂B其生产规模相对较小，奶源供应者很多为散养户，存在当地奶农卫生意识差，手工挤奶过程不注重卫生等情况，是造成天津地区原料奶污染较严重的主要原因。

2.3 原料奶中沙门氏菌的检测及分析

2.3.1 沙门氏菌生化反应鉴定

通过增菌培养之后，从选择性培养基上挑取可疑菌落，其中天津地区乳品厂A共挑取可疑菌株100株，乳品厂B共挑取97株，山西地区共挑取可疑菌株85株。经过三糖铁琼脂、赖氨酸脱羧酶等生化反应检测，共有5株菌符合要求，其生化反应情况见表3。

表3 初步筛选所得沙门氏菌可疑菌株Table 3 Preliminary screening of suspicious Salmonella strains

以上5株可疑菌均符合生化反应初步鉴别表中反应序号A3的反应，需要补做ONPG实验。经鉴定，这5株菌均为ONPG阳性反应，可判定这5株菌均为非沙门氏菌。

2.3.2 沙门氏菌属各生化群的鉴别

根据国标方法，进一步对可疑沙门氏菌进行生化群的鉴别。鉴别结果见表4。

表4 可疑沙门氏菌生化群鉴别结果Table 4 Biochemical characteristics of suspicious Salmonella strains

本实验所采集的样品数量较大，范围较广，检验采用了最新国家标准规定的方法，所以，实验结果反映的情况对津晋地区原料奶中沙门氏菌的污染程度具有一定的代表性。经过生化群的检验，可见这5株可疑菌均不符合生化分群结果，进一步判定所检奶样中无沙门氏菌，因此，可报告津晋地区原料奶中沙门氏菌未检出。

从一定程度上说，津晋地区原料奶中致病菌污染程度不高，即使天津地区乳品厂B的奶源质量较差，菌落总数几乎都超标，但仍未检出沙门氏菌，说明原料奶中菌落总数与沙门氏菌污染程度无直接对应关系。

3 结 论

3.1 原料奶的卫生学指标分析

根据2008年最新颁布的国标方法，对我国天津和山西两个地区的原料奶中菌落总数和大肠菌群数进行分析及鉴定。结果显示：天津地区乳品厂A奶源质量较好，菌落总数合格率达到60%；乳品厂B奶源质量较差，几乎均为超标奶；山西地区奶源质量较好，菌落总数合格率也达到70%，且多数奶源菌落总数数量级为104；大肠菌群数两个地区差异较大，山西地区受粪便污染程度较小，最高大肠菌群数仅为110MPN/mL；而天津地区的样品大肠菌群从15MPM/mL至大于11000 MPN/mL均存在。

3.2 原料奶中沙门氏菌的检测与鉴定

根据2008最新国标，对两个地区3个乳品厂的原料奶进行增菌培养、选择性培养及一系列生化鉴定，结果均报告无沙门氏菌检出。

4 展 望

原料奶位于乳业产业链的最上游，直接影响到乳品的质量与安全。从这个意义上讲，能否从源头上紧抓原料奶的质量控制，将直接关系到整个乳业的质量安全。而据李胜利等[25]及黄艾祥等[26]的研究，中国目前虽然形成了一些大的乳品产业，有一些固定的规模化奶牛场，但散养户占70%左右，对其卫生指标监控较低，且奶牛的饲料结构和质量差，良种覆盖率低，机械化挤奶效率低，约有80%的奶户采取手工挤奶，奶牛防疫难，奶站缺乏规范化管理，我国奶业的发展与发达国家相比落后很多。因此，政府部门和企业需要协力引导和扶持奶农以提高原料奶质量和增加单产。

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Analysis and Identification on Contamination Status of Raw Milk in Tianjin and Shanxi Regions

GAO Wen-ru，CHEN Qing-sen*，YAN Ya-li，PANG Guang-chang，HU Zhi-he
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Salmonella is one of the most important gastrointestinal pathogens for human and animals. Approximately 70%－80% of bacterial food poisoning cases are caused by Salmonella in China. Therefore, food poisoning caused by Salmonella has become one of the most common and comparatively pernicious bacterial species. The contamination in raw milk from Tianjin and Shanxi regions in China was investigated by determining total bacterial count and coliform bacteria and Salmonella bacteria. The results indicated that the quality of raw milk from different sources in the two regions exhibited a great difference. The average total bacterial counts varied from 104CFU/mL to 107CFU/mL. Most of the tested samples could meet the quality standard and few of them were unqualified. However, coliforms bacterial count exhibited tremendous difference among samples from different sources. The quality of raw milk from Shanxi region was better than that from Tianjin region. The coliforms bacterial count was lower than 110 MPN/mL in the samples from Shanxi region. However, The coliforms bacterial count in the samples from Factory A were up to 1100 MPN/mL and from Factory B were no less than 11000 MPN/mL, respectively, although no Salmonella was detected. Therefore, the quality and safety issues of raw milk from the two regions can not be ignored.

raw milk；microorganism；total bacterial count；coliforms bacteria；Salmonella；contamination

TS252.1

A

1002-6630(2010)17-0351-04

2010-04-19

国家科技攻关计划重大专题项目(2006BAD04A08)

高文茹(1984—)，女，硕士研究生，研究方向为生物活性物质、乳品质量与安全。

E-mail：gwr_2008@163.com

*通信作者：陈庆森(1957—)，男，教授，硕士，研究方向为发酵生物技术、蛋白资源开发与应用。E-mail：chqsen@tjcu.edu.cn