南美白对虾蛋白质酶解产物过敏原消减效果研究

王丽娟，胡志和，周 汛，陈照丽，吴海明

(1.天津市食品生物技术重点实验室，天津 300134；2.天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134)

南美白对虾蛋白质酶解产物过敏原消减效果研究

王丽娟1,2，胡志和1,2，周 汛2，陈照丽2，吴海明2

(1.天津市食品生物技术重点实验室，天津 300134；2.天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134)

采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶分解南美白对虾的蛋白质，以消减其中的蛋白质过敏原；应用全身过敏反应和离体回肠平滑肌过敏性收缩实验模型，对该工艺蛋白酶酶解产物的致敏性进行评价。结果显示，3种蛋白酶的虾蛋白酶解产物所致的全身过敏反应均明显减轻(与虾蛋白组比较，0.01＜P＜0.05或P＜0.01)；同时，3种酶解产物致敏的离体回肠平滑肌对虾蛋白和酶解产物过敏原攻击的反应也明显减弱(与虾蛋白致敏组比较，0.01＜P＜0.05或P＜0.01)。综合评价3种酶解产物的致敏性，认为木瓜蛋白酶的酶解工艺较好，过敏原消减比较理想，食用更安全。

南美白对虾；胰蛋白酶；木瓜蛋白酶；菠萝蛋白酶；过敏实验

近年来，食品安全问题已成为人们普遍关心的问题。其中食物过敏问题也越来越受到人们的重视，它是某些严重过敏性疾病发病的诱因[1]。海产品作为人类一种重要的食物性蛋白质的来源，深受人们的喜爱。然而，虾与蟹等甲壳类动物及其制品又是引起食物过敏较常见的一类食品，且多数为终生过敏[2]。因此，研究虾过敏及虾过敏原，探索消减虾过敏原的工艺技术，进一步为开发低敏及脱敏的虾类制品奠定基础。本研究通过观察并比较南美虾蛋白酶解产物的全身性过敏反应及对豚鼠回肠平滑肌的致敏作用，以评价和比较虾蛋白酶解工艺，寻找削减虾蛋白过敏原的工艺技术。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

南美白对虾(活) 市售。

卵白蛋白(Ⅱ型) 美国Sigma公司；南美虾蛋白、3种虾蛋白酶解产物 实验室自制；扑尔敏(批号0903006)天津力生制药股份有限公司。

表1 全身过敏反应致敏与激发方法Table 1 Sensitization and stimulation methods of general allergic reactions

1.2 实验动物

英国种Hartly豚鼠，体质量170～250g，雌雄各半，由天津市实验动物中心提供，合格证号为SCXK津2005-0001。

1.3 仪器与设备

BL-420F生物信号采集系统 成都泰盟科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 南美白对虾蛋白的制备

将南美白对虾去壳去头去尾去肠线后放在匀浆器中匀浆，然后加入4倍体积的冷丙酮(－20℃预冷过夜)，4℃、8000r/min离心15min，收集沉淀物，将沉淀物转移至干净的滤纸上，分散并让其在室温下空气中风干后粉碎，之后用抽提液(1mol/L KCl、0.5mmol/L DTT(1,4-dithiothreitol，pH7.4)按1:10的比例抽提过夜，再次4℃、8000r/min离心15min，取上清，沉淀用抽提液继续抽提4h，离心取上清。透析过夜，两次获得的上清液合并后冷冻干燥，于－20℃的冰箱中保存备用。

1.4.2 南美虾蛋白酶解产物的制备

将南美虾蛋白用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶进行分解，其酶解条件为胰蛋白酶：pH8.0，酶与底物比1:100，45℃，底物质量浓度3g/100mL；木瓜蛋白酶：pH6.5，酶与底物比1:100，60℃，底物质量浓度3g/100mL；菠萝蛋白酶：pH7.5，酶与底物比1:100，55℃，底物质量浓度5g/100mL。在酶解过程中，注意控制酶解液的pH值，酶解时间均为3h。酶解结束后，将酶解液pH值至中性，用80℃灭酶10min，冷冻干燥备用[3-4]。

1.4.3 全身过敏反应

将48只豚鼠随机分为8组，每组6只，雌雄各半。在实验室适应1周后进行初次致敏，激发时静脉注射不成功者舍弃。各组的致敏与激发方法见表1。致敏期间每天两次观察豚鼠的反应，包括一般状态、进食、有无过敏反应等。激发后立即观察60min内动物的反应，观察指标及过敏反应评定标准见表2[5]。

表2 豚鼠过敏反应判定标准Table 2 Evaluation standards for allergic reactions in guinea pigs

1.4.4 致敏豚鼠离体回肠平滑肌过敏性收缩实验

将豚鼠随机分为7组，每组4～5只。各组先用卵白蛋白等致敏物质进行致敏。致敏时进行腹腔注射，每次1.0mL/只，隔日1次，共3次。末次注射后第14天进行离体肠平滑肌过敏原攻击实验，取致敏豚鼠，放血处死，取出回肠一段，按离体器官装置进行描记，浴管内均加入30mL台氏液。待肠收缩曲线基线稳定后，进行过敏抗原攻击，观察、记录肠收缩幅度[6]，并比较各组肠收缩变化率。

式中：F1为攻击后的肠平滑肌收缩力/g；F0为攻击前的肠平滑肌收缩力/g。

1.5 数据处理

采用方差分析和t检验，所有实验数据均以x±s表示。

2 结果与分析

2.1 全身过敏反应

按照表1的分组和表2的评判指标和评分标准，对卵白蛋白、南美虾蛋白及其酶解产物各组豚鼠分别进行致敏和激发，在致敏和激发后密切观察、记录，并进行评分。各组动物全身过敏反应的结果见表3。

表3 动物全身过敏反应结果与评分Table 3 Results and scores of general allergic reactions in guinea pigs

由表3可以看出，南美虾蛋白存在有明显的过敏反应，表现为Ⅰ型速发型变态反应，严重者出现过敏性休克而死亡，反应与阳性对照品卵白蛋白极其相似。而虾蛋白酶解产物的过敏反应则明显减轻，不论用虾蛋白致敏，还是用各种虾蛋白酶解产物致敏，再分别用各种虾蛋白酶解产物激发后的全身过敏反应发生率均明显降低，过敏反应的表现均明显减轻。

2.2 致敏豚鼠离体回肠平滑肌过敏性收缩实验

将卵白蛋白、南美虾蛋白以及3种虾蛋白酶解产物致敏并攻击后的离体回肠平滑肌收缩活动的变化汇总见表4。通过分析并比较各组肠平滑肌在攻击前后收缩力的变化，评价各酶解产物过敏原消减的效果。

表4 卵白蛋白、南美虾蛋白以及3种酶解产物的致敏作用比较Table 4 Comparison of allergic effects of egg-white protein, South American white shrimp protein and its hydrolysates prepared with three proteases

从表4及图1中可以看出，用各蛋白酶酶解产物致敏后，无论用虾蛋白过敏原攻击还是用酶解产物进行攻击，肠平滑肌的收缩均较卵白蛋白和虾蛋白致敏组明显减弱，而且肠平滑肌对相同浓度的扑尔敏反应也较弱，经扑尔敏作用后，致敏的肠平滑肌对酶解产物的攻击反应也减弱，说明各酶解产物的致敏性明显降低。剪辑肠收缩曲线见图1。

图1 致敏回肠平滑肌在过敏原攻击前后的收缩曲线Fig.1 Contraction curves of isolated ileum smooth muscle before and after allergic attack

3 讨 论

近年来，国外有报道[7]称过敏性疾病的发生呈上升趋势，食品过敏是过敏性疾病的一种，可能成为某些严重过敏性疾病的诱因。国内调查，健康人群自诉有食物过敏的占5.7%，其中皮肤点刺实验阳性者占自诉曾患食物过敏的33.5%，占被调查人数的1.9%[8]。与成人相比，儿童食物过敏的发生率较高，重庆地区0～24个月儿童，家长自诉有食物过敏的为13.7%，被确诊食物过敏的占5.7%[9]。在致敏的食物中，虾及蟹等海鲜类食品过敏的人较多，食用虾等海产品过敏引起过敏性休克的病例并非罕见[10-11]。食物过敏是一个非常复杂的反应过程，临床数据显示，90%以上的食物过敏属于Ⅰ型(速发型)变态反应[12]，包括3个阶段，即食物过敏原的致敏阶段、激发阶段和效应阶段。过敏体质的人群，食入过敏原可诱导机体产生IgE抗体[13]；当再次接触该类食物，过敏原与致敏肥大细胞、嗜碱性粒细胞表面IgE抗体特异性结合，使之脱颗粒，释放出组胺、5-羟色胺、白三烯等生物活性物质，作用于效应组织和器官，引起局部或全身过敏反应[14]。食物过敏可以累及全身许多脏器，如口腔、消化道、呼吸道、皮肤及心血管等，引起各种临床表现，如恶心、呕吐、腹痛、腹泻，甚至出现呼吸困难、休克，进而危及生命[15]。因此，设法消除虾中的过敏原，让人们吃的安全十分必要。据文献报道[16]，多种蛋白酶能够对甲壳类动物过敏原产生良好的降解作用。

该实验工艺提取的虾蛋白过敏原具有很强的过敏性，其过敏反应的强度或效价与卵白蛋白相近，但全身过敏反应发生的速度较卵白蛋白稍慢(与卵白蛋白比较，P＞0.05)，证明该工艺提取虾蛋白过敏原可行。用该虾蛋白酶解的各种产物的全身过敏反应及致敏的豚鼠回肠平滑肌收缩实验中，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶酶解产物的致敏性均明显降低，但均未能完全消除。综合分析全身过敏反应和豚鼠回肠平滑肌收缩实验的结果，认为木瓜蛋白酶酶解产物的反应发生率较低，反应的表现较轻，食用的安全性较高。下一步研究将放在优化消减过敏原的工艺上，使虾过敏原消减效果更加理想。

[1] KULIG M, BERGMANN R, TACKE U, et al. Long-lasting sensitization to food during the first two years precedes allergic airway disease. The MAS Study Group, Germany[J]. Pediatr Allergy Immunol, 1998, 9 (2): 61-67.

[2] ALTMAN D R, CHIARMAONTE L T. Public perception of food allergy[J]. Allergy Clin Immunol, 1996, 97(6): 1247-1251.

[3] 王晓雯. 中国对虾主要过敏原的鉴定及性质的研究[D]. 青岛: 中国海洋大学, 2008.

[4] 赵振兴. 虾过敏原免疫活性的研究[D]. 青岛: 中国海洋大学, 2006.

[5] 徐叔云, 卞如濂, 陈修. 药理实验方法学[M]. 3版. 北京: 人民卫生出版社, 2003: 1411.

[6] 徐叔云, 卞如濂, 陈修. 药理实验方法学[M]. 2版. 北京: 人民卫生出版社, 1991: 1200.

[7] HUNSON L, TELEMO E. The growing allergy problerm[J]. Acta Paediatr, 1997, 86(9): 916-918.

[8] 吕相征, 刘秀梅, 杨晓光. 健康人群食物过敏状况的初步调查[J]. 中国食品卫生杂志, 2005, 17(2): 119-121.

[9] 胡燕, 黎海芪. 0～24个月儿童食品过敏的流行病学研究[J]. 中华儿科杂志, 2000, 38(7): 431-434.

[10] 安爱芝, 孙月芹. 食坑虾引起过敏性休克1例[J]. 医学理论与实践, 2003, 16(8): 87.

[11] 许岩, 许红. 食用虾爬子引起过敏性休克1例[J]. 沈阳医学院学报, 2000, 2(2): 108.

[12] TYALOR S L, SMUMER S S. Food allergies and related diseases and IFT outstanding symposium[J]. Food Technology, 1992, 46(5): 135-136.

[13] LIN X P, MAGNUSSON J, AHLSTEDT S, et al. Local allergic reaction in food-hypersensitive adults despite a lack of systemic food-hypersensitive IgE[J]. J Allergy Clin Immunol, 2002, 109(5): 879-887.

[14] COEFFIER M, LORENTZ A, MANNS M P, et al. Epsilon germ-line and IL-4 transcripts are expressed in human intestinal mucosa and enhanced in patients with food allergy[J]. Allergy, 2005, 60(6): 822-827.

[15] BISCHOFF S, CROWE S E. Gastrointestinal food allergy: new insights into pathophysiology and clinical perspectives[J]. Gastroenterology, 2005, 128(4): 1089-1113.

[16] SHIMAKURA K, TONOMURA Y, HAMADA Y, et al. Allergenicity of crustacean extractives and its reduction by protease digestion[J]. Food Chemistry, 2005, 91(2): 247-253.

Elimination of Allergens in South American Shrimp by Protease Hydrolysis

WANG Li-juan1,2，HU Zhi-he1,2，ZHOU Xun2，CHEN Zhao-li2，WU Hai-ming2
(1. Tianjin Key Laboratory of Food Technology, Tianjin 300134, China；2. College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

In order to eliminate the allergens in South American shrimp, proteases such as trypsin, papain and bromelain were individually used to hydrolyze South American shrimp proteins. General immunity experiments in allergic guinea pigs and allergic contraction experiments of isolated ileum were used to evaluate the allergenicity of hydrolysates. The results showed that hydrolysates from South American shrimp proteins digested by each of the three proteases could result in an obvious attenuation of general allergic reactions (Compared with the group of South American shrimp protein, 0.01＜P＜0.05 or P＜0.01). Meanwhile, a reduced allergic contraction reaction of isolated ileum smooth muscle was observed in hydrolyzed South American shrimp proteins (Compared with the group of South American shrimp protein, 0.01＜P＜0.05 or P＜0.01). Comprehensive evaluation exhibited that papain hydrolysates could provide an excellent elimination effect on allergens and higher food safety.

South American white shrimp；trypsin; papain；bromelain；hypersensitive test

TS201.6；R151.41

A

1002-6630(2010)17-0263-04

2010-04-01

“十一五”国家科技支撑计划重大项目(2008BAD94B09)

王丽娟(1961—)，女，教授，硕士，主要从事食品毒理学研究。E-mail：wljuan@tjcu.edu.cn