冬季贮存甜瓜腐烂病原菌的分离与鉴定

阿不都外力·阿不都热依木，孙 磊，古丽斯玛依·艾拜都拉，艾尔肯·艾米尔，邝海菊，孜来古丽·米吉提，艾尔肯·热合曼，古丽斯玛依·艾拜都拉,*

(1.新疆大学生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830046；2.新疆大学理化测试中心，新疆 乌鲁木齐 830046)

冬季贮存甜瓜腐烂病原菌的分离与鉴定

阿不都外力·阿不都热依木1，孙 磊1，古丽斯玛依·艾拜都拉1，艾尔肯·艾米尔2，邝海菊1，孜来古丽·米吉提1，艾尔肯·热合曼1，古丽斯玛依·艾拜都拉1,*

(1.新疆大学生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830046；2.新疆大学理化测试中心，新疆 乌鲁木齐 830046)

从冬季贮存甜瓜的腐烂组织中分离病原菌，并对其类型进行检测分析。利用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基和溶菌肉汤(LB)培养基培养，依据微生物形态特性，真菌的26S rRNA序列和细菌的16S rRNA序列比对以及系统发育进化分析等分子生物学方法，共分离到22株菌种，其中真菌13株：包括青霉2株、链格孢4株、白地霉4株、酵母3株(梅奇氏酵母2株、毕赤酵母1株)；细菌9株：包括沙雷氏菌5株，丁香菌1株，克雷伯菌、肠杆菌和芽孢杆菌各1株。根据26S rRNA D1/D2区序列比对和系统进化树结果显示，两株酵母菌121和122可能是梅奇氏酵母属潜在的新种。青霉和链铬孢是甜瓜腐烂致病菌，白地霉和沙雷氏菌是人体致病菌，表明目前甜瓜贮存方法需要进一步改进和完善。

冬季腐烂甜瓜；病原菌；分离；鉴定；16S rRNA；26S rRNA

甜瓜是新疆一种重要的经济作物，新疆早熟甜瓜从6月就开始采摘上市，晚熟甜瓜可以保存至次年的2月份。实际上，直至每年的5月初在新疆各地市场都可见到冬季贮存甜瓜的销售食用。冬季贮存的甜瓜作为新疆一种特有的贯穿秋、冬、春季的瓜果，在水果中具有极长的食用期和极高的保鲜价值。冬储甜瓜的腐烂率可高达30%以上，很大程度上降低了贮存甜瓜的食用品味、经济价值和卫生安全性。

贮藏期间适宜的温度是保持甜瓜优良品质、减少腐烂和延长贮藏期的重要条件。低温贮运虽然可以延缓甜

瓜果实的生理衰老、抑制病菌侵染和减少腐烂损耗，但是甜瓜果实对低温较为敏感，尤其是在低于零度的条件下甜瓜易受冻害，解冻后常失去食用与商品价值。果蔬采摘后的病害由两种侵染引起：采收以后病原菌通过机械伤口侵染和生长期间的潜伏侵染[1]。

国内外对甜瓜贮藏期间病害的研究有许多报道，主要病害为软腐病、红粉病、白霉病、黑斑病、青霉病等[2-5]。梁宁等[6]通过形态观察，从贮藏期甜瓜的病变组织中分离出7个类型的病原真菌，毛晓英等[7]也用同样的方法大致分离出4个类型的甜瓜贮藏期病原真菌。本实验对保鲜库中保藏的冬储甜瓜腐烂组织中分离的真菌进行形态观察、表型分析，使用26S rRNA序列比对进行初步的分类学鉴定；并且对免疫性下降的甜瓜腐烂组织的细菌类群也进行检测。选择冬季贮存甜瓜为研究对象，探索其腐烂组织微生物类型，不仅对食品安全性具有重要意义，也为进一步改善贮存条件，选育甜瓜优良品系提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冬季伽师瓜(金皇后86-1)购自乌鲁木齐水果批发市场冷库。

DNA聚合酶和dNTP、10×PCR Buffer 天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 培养基

溶菌肉汤(LB)培养基、马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基。参照文献[8]进行配制。

1.3 方法

1.3.1 冬季腐烂甜瓜病原菌的分离纯化

用无菌解剖刀切去致病组织表皮，取出染病组织，观察染病的特征，然后把染病甜瓜组织切成0.5cm2的小片贴在PDA培养基中培养。将培养物稀释到10-1、10-3、10-5、10-7、10-9、10-10在6组LB和PDA固体培养基上用涂布棒均匀涂布，将接种后的培养物分别放入恒温箱中倒置培养，LB培养基培养温度为37～38℃，PDA培养基的培养温度为30℃；过夜后观察其生长情况，利用平板划线技术分离纯化菌株。

1.3.2 菌落形态及菌体形态观察

真菌通过观察菌落特征，制作菌丝压片，显微镜观察孢子的形态结构特征。对细菌菌落形态及通过简单染色、革兰氏染色对细菌细胞形态进行观察[9]。

1.3.3 菌种的分子生物学鉴定

真菌基因组DNA的提取参照文献[10]进行。细菌基因组DNA通过CTAB法[11]提取。

真菌26S rRNA D1/D2区序列扩增与扩增条件参照文献[12]扩增，正向引物序列为P8：5′-GCATATCAA TAAGCGGAGGAAAAG-3′，反向引物序列为P9：5′-GGTCCGT GTTTCAAGACGG-3′。细菌基因组16S rRNA扩增与扩增条件参照文献[13]扩增，正向引物序列为P1：5′-AGA GTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物序列为P2：5′-A CGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。引物合成和PCR产物测序由上海生工生物工程有限公司完成。在NCBI网上BLAST比对测序结果，从GenBank中查找与目的基因序列同源性最高的已知分类地位的菌种进行鉴定分离菌株。另外从GenBank中提取所有与目的基因序列相关的已知的标准菌株的序列。通过软件MEGA 4.0处理已有的全部序列，采用MEGA 4.0软件中的N-J构树法构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 真菌的分离与鉴定

图1 梅奇氏酵母菌121和122基于26S rRNA D1/D2区序列构建系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree based on the 26S rRNA D1/D2 regions of strain 121 and strain 122

通过PDA培养基培养，从两种腐烂甜瓜组织中共分离到13株真菌。从形态特性和26S rRNA D1/D2序列同源性(表1)上比较，显示菌株S11、S12、S13、XJU8与链格孢属，菌株S14、S15与青霉属，S16、S17、S18、S19与白地霉属和菌株121、122、XJURML1与酵母属等4个属菌种之间的亲缘关系很近。根据26S rRNA D1/D2序列同源性构建的系统进化树也支持此结果。因此分离的这些真菌初步鉴定为链铬孢属(S11、S12、S13、XJU8)，白地霉属(S16、S17、S18、S19)，青霉属(S14、S15)和酵母属(121、122、XJURML1)的变种。分离的两株酵母121和122分别与M. bicuspidata CBS 5575 (L10685)和M. fructicola(AF360542)的26S rRNA D1/D2区序列相似性为98.10%和97.60%。而且菌株121和122基于26S rRNA D1/D2区序列同源性构建的系统发育进化树上以83%的自展值在与M. bicuspidata CBS 5575 (L10685)和M. fructicola(AF360542)相邻的小分支上聚类在一起(图1)。此结果表明这两株可能是梅奇氏酵母属潜在的新种。

表1 真菌26S rRNA D1/D2区序列同源性比较Table 1 Sequence similarity of 26S rRNA D1/D2 region in fungi

2.2 细菌的分离与鉴定

通过LB培养基培养，从两种腐烂甜瓜组织，共分离到9株细菌；这些菌株中革兰氏阴性细菌占绝对优势，分离的9株菌中8株为革兰氏阴性细菌。16S rDNA序列同源性显示，菌株S1、S3、S4、S7、S11与沙雷氏菌属，菌株S13与肠杆菌属，菌株S2与克雷伯菌属，菌株S12与假单孢菌属，菌株S5与芽孢杆菌属等5个属已报道的标准菌株16S rDNA序列同源性均高于98.96%以上(表2)。基于16S rDNA序列同源性构建的系统进化树也支持以上结果。根据此结果，初步鉴定分离的细菌菌株极可能是以上5个属已知菌种的变种。

表2 冬季贮存腐烂甜瓜中获得的细菌菌落形态特性和16S rDNA同源性比对Table 2 Morphological characteristics of colonies and 16S RNA sequence similarity of strains isolated from decayed melon stored in winter

2.3 冬贮甜瓜腐烂组织微生物类型的分析

国内外对甜瓜贮藏期间病害研究很多，其结果都显示青霉和链铬孢是甜瓜主要腐烂致病菌，链铬孢在水果中产生的黑斑病较为常见[1,5-7]。其次白地霉能产生亚硝胺、亚硝酸盐等致癌物质对人类健康有着极大的危害性[14]。从26S rRNA D1/D2区序列相似性比对结果来看白地霉的3株(S16、S18、S19)与Geotrichum sp.同源性只有98%(表2)，可能是新变种。两株酵母121和122的26S rRNA

D1/D2区序列与GeneBank数据库中最近缘酵母菌株的同源性均低于98.10%，而且在系统进化树中的靴带值高达83%，表明是潜在的新种[15]，所分离的细菌类群中沙雷氏菌属是在自然界中作为人类的条件致病菌，该属有的种可能与人类菌血症有关[16]。本实验分离的菌株中沙雷氏菌属的菌株类型最多(5株)，表明有害细菌类群在腐烂甜瓜组织中的存在较丰富。

在冬季甜瓜贮藏上，目前常用低温控制结合化学灭菌。但是在本研究中发现，低温条件下，所分离的真菌和细菌仍然有较强的繁殖能力，表明了低温对此次分离的病原菌抑制作用不显著，基于食品安全性的考虑对此应当给与足够的重视；冬储处理过程中避免链铬孢、青霉、白地霉和沙雷氏菌的污染最为关键；因此，冬储甜瓜保鲜的方法需要进一步改进完善。

3 结 论

本实验共分离22株菌种：真菌13株，隶属于4个(青霉、链铬孢、白地霉、梅奇氏酵)属；细菌9株，隶属于5个(沙雷氏菌、肠杆菌、克雷伯菌、假单孢菌、芽孢杆菌)属。青霉和链铬孢是甜瓜腐烂致病菌。其次白地霉和沙雷氏菌属是人类致病菌。根据26S rRNA D1/D2区序列比对和系统进化树结果表明两株酵母菌121和122是潜在的新种，有鉴定酵母新种的意义。

[1] BARKAI-GOLAN R. Postharvest diseases of fruits and vegetables: Development and control[M]. Elsevier Science B V, 2001: 54-65.

[2] 葛林梅, 李红叶, 张明方, 等. 甜瓜细菌性软腐病病原鉴定[J]. 果树学报, 2006, 23(3): 427-430.

[3] 李宝聚, 李龙生, 顾兴芳, 等. 瓜类红粉病的病原鉴定、发生与防治[J]. 中国蔬菜, 2005(6): 55-56.

[4] 马凌云, 赵亮. 嘧菌酯处理对“银帝"甜瓜采后病害控制的研究[J].信阳农业高等专科学校学报, 2009, 19(4): 118-119.

[5] 张玉红, 张凡江. 甜瓜黑斑病的发生与防治[J]. 现代化农业, 2007(9): 44-45.

[6] 梁宁, 李喜宏, 王冬洁. 不同药剂对贮藏期哈密瓜真菌病害的抑制效果[J]. 安徽农业科学, 2006, 34(10): 2247-2248.

[7] 毛晓英, 吴庆智, 刘晓航, 等. 新疆哈密瓜采后主要致腐病原真菌的分离与鉴定[J]. 安徽农学通报. 2006, 12(12): 120-121.

[8] 钱存矛, 黄仪秀, 林雅兰, 等. 微生物学试验教程[M]. 北京: 北京大学出版社, 2007: 215.

[9] 沈萍. 微生物学实验[M]. 北京: 高等教育出版社, 2001: 44-46.

[10] LABUDA R, ELIAS P, Jr, SERT H, et al. Alternaria Jesenskae sp. nov., a new species from Solvakia on Fumana procumbens (Cistaceae)[J]. Microbiological Research, 2008, 163(2): 208-214.

[11] 林加涵, 魏文铃. 现代生物学试验: 下册[M]. 北京: 科学出版社, 2001: 94-387.

[12] NIELSEN D S, JAKOBSEN M, JESPERSEN L. Candida halmiae sp. nov., Geotrichum ghanense sp. nov. and Candida awuaii sp. nov., isolated from Ghanaian cocoa fermentations[J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2010, 60: 1460-1465.

[13] CLARRIDGE J E, Ⅲ. Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases [J]. Clin Microbiol Rev, 2004, 17(4): 840-862.

[14] 刘宁, 沈明浩. 食品毒理学[M]. 北京: 中国轻工业出版社, 2005: 240-245.

[15] SUGITA T, TAKASHIMA M, SHINODA T, et al. New yeast species, Malassezia dermatis, isolated from patients with atopic dermatitis[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2002, 40(4): 1363-1367.

[16] 东秀珠, 蔡英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京: 科学出版社, 2001: 252.

Isolation and Identification of Decay-inducing Pathogens from Melon Stored in Winter

Abduwali ABDUREYIM1，SUN Lei1，Gulsumay ABAYDULLA1，Erkin AMIR2，KUANG Hai-ju1，Zilaygul MIJIT1，Erken RAHMAN1，Gulsumay ABAYDULLA1,﹡
(1. College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, China；2. Center of Analysis and Measurement, Xinjiang University, Urumqi 830046, China)

Isolation and identification of pathogens from the decayed tissues of melon stored in winter were carried out using LB (lysogeny broth) and PDA (potato dextrose agar) media. Based on morphological characteristics, D1/D2 region of 26S rRNA sequences for fungi, 16S rRNA gene sequences for bacteria and phylogenetic trees, a total of 22 strains were isolated. Thirteen of them belonged to the family of fungi, including 2 strains of the genus Penicillium, 4 strains of the genus Alternaria, 4 strains of the genus Geotrichum, and 3 yeast strains (2 strains of the genus Metschnikowia and 1 strain of the genus Pichia); the rest were all bacteria, including 5 strains of Serratia. sp, 1 strain of cloves. sp, 1 strain of Klebsiella. sp, 1 strain of Enterobacter. sp and 1 strain of Bacillus. sp. The results of 26S rRNA and phylogenetic tree analysis revealed that 2 isolates (strain 121 and strain 122) were yeast, which may be a new species belonging to the genus Metschnikowia. Alternaria and Penicillium were pathogenic fungi for melon, and Geotrichum and Serratia. sp were pathogens for human. Therefore, these investigations demonstrate that current conditions for winter storage of melon should be improved.

decayed melon；winter storage；pathogens；isolation；identification；16S rRNA；26S rRNA

Q946

A

1002-6630(2010)17-0250-04

2009-12-23

新疆维吾尔自治区科技支疆武汉大学合作项目(201091236)

阿不都外力·阿不都热依木(1982—)，男，硕士研究生，研究方向为资源微生物学。E-mail：abduwaly@gmail.com

*通信作者：古丽斯玛依·艾拜都拉(1963—)，女，副教授，硕士，研究方向为资源微生物学。

E-mail：gulsimay2005@yahoo.com.cn