具有胃黏膜保护作用的羊肚菌菌株的筛选及其液体发酵

2010-03-23余梦瑶郑林用姬超宏葛绍荣

食品科学 2010年17期

任丹，罗霞，余梦瑶，郑林用，魏巍,4，姬超宏，葛绍荣,*

(1.四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，四川成都 610064；2.四川省中医药科学院，四川成都 610041；3.四川省农业科学院土壤肥料研究所，四川成都 610066；4.德阳市食用菌专家大院，四川德阳 618003)

任丹1,2，罗霞2，余梦瑶2，郑林用1,3,4，魏巍1,2,4，姬超宏1，葛绍荣1,*

目的：筛选获得具有胃黏膜保护作用且生物量较高的羊肚菌菌株，并优化所获得菌株的发酵培养基，筛选获得对胃黏膜保护效果较好的羊肚菌发酵培养基中的碳、氮源。方法：将小鼠随机分为正常组、模型对照组和不同给药剂量组，以无水乙醇诱导胃黏膜损伤为模型，比较各组胃黏膜损伤指数，同时测定并比较不同羊肚菌菌株生物量；利用碳氮源单因素和正交试验，以胃黏膜损伤指数为主要筛选指标，同时测定并比较不同培养基发酵羊肚菌菌株生物量与胞外多糖含量。结果：羊肚菌M1液体发酵物的水提液，能显著降低小鼠急性酒精胃黏膜损伤的损伤指数(P＜0.05)，同时生物量达到10.28g/L；分别以可溶性淀粉与酵母膏为碳、氮源时M1液体发酵物的水提液对小鼠胃黏膜保护效果最好，抑制率分别达到80.92%、53.02%；正交试验结果表明：以质量分数2.0%可溶性淀粉和1.5%酵母膏组合时M1液体发酵物的水提液对小鼠胃黏膜保护效果较好，抑制率达到76.02%，生物量达到8.88g/L。结论：羊肚菌M1不仅对小鼠胃黏膜具有较好的保护作用，而且生物量较高，其对胃黏膜保护效果较好的发酵培养基中的最适碳、氮源为可溶性淀粉2.0%、酵母膏1.5%。

羊肚菌；无水乙醇；胃黏膜损伤；液体发酵

羊肚菌隶属于子囊菌亚门(Ascomycotina)盘菌纲(Discomycetes)盘菌目(Pezizales)羊肚菌科(Morchellaceae)羊肚菌属(Morchella)[1]。羊肚菌以其菌盖表面生有许多小凹坑，外观极似羊肚而得名[2]，是一种野生名贵食(药)用菌，肉质脆嫩可口。传统中医认为羊肚菌性平味甘，可入药，具有益肠消食、化痰理气、润胃健脾等功效[3]。吴映明等[4-5]研究称羊肚菌子实体水溶性提取液具有加强小肠推进和促进胃排空的功效。中医和现代医学关于羊肚菌对胃肠道保护作用的记载及研究仅限于其子实体，而且目前羊肚菌还不能进行规模化人工栽培，同时利用羊肚菌液体发酵物(菌丝体)的水提液研究其对胃黏膜的保护作用还未见报道。针对以上问题，本实验利用液体发酵技术，研究其发酵物水提液对无水乙醇致小鼠胃黏膜损伤的保护作用，筛选获得对小鼠胃黏膜具有保护功效的羊肚菌菌株，并优化其发酵培养基，以期为具有养胃功效的羊肚菌新产品的开发提供工业化生产的新原料。

1 材料与方法

1.1 菌株与培养基

羊肚菌(Morchella spp.)M1～M9由四川省中医药科学院中药细胞与分子生物学实验室分离、保存。

PDA改良培养基(组分按质量分数配制)：土豆200g、葡萄糖2.0%、蛋白胨0.2%、KH2PO40.15%、MgSO40.05%、琼脂1.5%。

1.2 实验动物

昆明种小鼠(SPF级，合格证号：SCXK(川)2005-19)，体质量(20±2)g，由四川省中医药科学院动物所提供。

1.3 试剂

葡萄糖、蛋白胨、无水乙醇成都市科龙化工试剂厂；MgSO4·7H2O、KH2PO4、35%甲醛溶液成都化学试剂厂，以上试剂均为分析纯。

1.4 方法

1.4.1 羊肚菌液体发酵物(菌丝体)水提液(简称羊肚菌水提液)的制备

把分离好的羊肚菌菌株转接到PDA斜面，于27℃培养7d[6]；然后转接到装有250mL PDA培养液的500mL三角瓶内，27℃、150r/min进行液体种子培养，培养7d；最后以体积分数10%的接种量转到装有250mL相同培养基的500mL三角瓶内进行液体发酵，在相同条件下培养7d。将发酵物水提、浓缩(3:1)，即可。

1.4.2 具有胃黏膜保护作用的羊肚菌菌株筛选及其生物量的测定

1.4.2.1 羊肚菌水提液对小鼠胃黏膜保护损伤指数测定

昆明种小鼠，每组10只，雌雄各半，随机分组：正常组、模型对照组和给药组。给药组灌胃给予羊肚菌水提液40mL/(kg bw·d)，正常组和模型对照组灌胃给予同等体积的蒸馏水。小鼠连续灌胃14d，实验结束前一天禁食不禁水24h，第14天正常组和模型对照组灌胃蒸馏水，给药组灌胃样品，30min后，除正常组外各组灌胃无水乙醇10mL/kg bw，1h后颈椎脱臼处死小鼠取胃，用生理盐水冲洗，然后放入体积分数10%甲醛溶液固定30min，沿胃大弯剪开胃，在解剖镜下观察胃黏膜损伤情况[7-10]。用Guth等[11]方法计算损伤指数：点状糜烂记为1分，小于lmm记为2分，1～2mm记为3分，3～4mm记为4分，大于4mm记为5分。

1.4.2.2 羊肚菌菌株生物量测定

将发酵液过滤，滤液留用，所得菌丝体用蒸馏水反复洗涤，置于80℃干燥箱中烘干至质量恒定，按文献[12]方法测定生物量。

1.4.3 碳、氮源的单因素筛选试验

1.4.3.1 碳源筛选试验

在PDA培养基中分别以蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、玉米粉、麦芽糖和乳糖代替土豆和葡萄糖作为碳源，碳源质量分数都为2.0%，其他成分和条件与PDA培养基相同，进行摇瓶发酵。然后对发酵产物进行胃黏膜损伤指数、生物量、胞外多糖含量的测定。

1.4.3.2 氮源筛选试验

在PDA培养基中分别以牛肉膏、酵母膏、黄豆粉、硫酸铵和麦麸代替蛋白胨作为氮源，麦麸需煮沸取汁，氮源质量分数都为0.2%，其他成分和条件与PDA培养基相同，进行摇瓶发酵。然后对发酵产物进行胃黏膜损伤指数、生物量、胞外多糖含量的测定。

1.4.4 碳、氮源正交试验

在碳、氮源的单因素筛选试验基础上，以胃黏膜损伤指数、生物量、胞外多糖含量为考察指标，设计L9(34)正交试验，发酵条件与上述相同，设3个重复[13-14]，因素水平设计见表1。

表1 碳、氮源正交试验设计表Table 1 Factors and levels in the complete combination design

1.5 胞外多糖含量测定

准确量取2mL过滤所得的滤液，5000r/min离心10min，取上清液加3倍体积的无水乙醇，置冰箱中24h后，再于5000r/min离心10min，弃去上清液，取沉淀溶于一定量去离子水中稀释，用硫酸-蒽酮法[15]测定胞外多糖含量。

1.6 数据处理

采用Excel处理数据，胃黏膜损伤指数用x±s表示，数据比较用t检验。

2 结果与分析

2.1 具有胃黏膜保护作用的羊肚菌菌株筛选及其生物量的比较

表2 不同处理的羊肚菌水提液对小鼠胃黏膜损伤的影响Table 2 Amounts of biomass of different Morchellas spp. strains and protective effects of their water extracts against gastric mucosa lesion

无水乙醇所致小鼠胃黏膜损伤，多呈点状或条索状，多在腺胃部发生。从表2可以看出，M1、M2和M3给药组胃黏膜损伤指数显著低于模型对照组(P＜ 0.05)，其抑制率分别达到了83.94%、74.06%和90.12%；M4～M9损伤指数虽然低于模型对照组，但是与模型对照组比较无显著差异(P＞0.05)。从表2还可以看出，M1菌株的生物量最大，达到了10.28g/L，其次是M4，也达到了9.79g/L。M5菌株的生物量最低，仅有7.73g/L。综合考虑，认为羊肚菌M1对胃黏膜保护作用较好同时生物量较高，因此选择羊肚菌M1作为下一步研究的出发菌株。

2.2 不同碳源发酵M1的水提液对胃黏膜的保护作用

表3 不同碳源发酵M1的水提液对胃黏膜的保护作用Table 3 Effect of carbon source type on the inhibition rate of the water extract from strain M1 against grastric mucosa lesion, its biomass and extracellular polysaccharide production

从表3可以看出，以蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、玉米粉和麦芽糖作为碳源时，其所培养的M1的水提液对小鼠胃黏膜的损伤指数与模型对照组相比，均具有极显著差异(P＜0.01)，说明对小鼠胃黏膜具有保护性作用；以乳糖为碳源培养的M1水提液对小鼠胃黏膜损伤指数与模型对照组相比，没有显著性差异(P＞0.05)，对胃黏膜没有保护作用。

从表3还可以看出，羊肚菌在这6种碳源中都可以生长，其中麦芽糖为其生长最适的碳源，生物量达到6.87g/L；其次为可溶性淀粉和葡萄糖，生物量分别为6.53g/L和5.73g/L。乳糖为碳源时，生物量最低，仅有3.42g/L。

不同碳源对M1胞外多糖的影响表明，以葡萄糖为碳源时的胞外多糖含量最高，达到2.712mg/mL，蔗糖最小，仅有1.050mg/mL，其大小顺序为：葡萄糖＞可溶性淀粉＞乳糖＞玉米粉＞麦芽糖＞蔗糖。

综合考虑，以可溶性淀粉为碳源时，其发酵的M1的水提液对胃黏膜保护效果最好，且生物量和胞外多糖含量较高，选择可溶性淀粉为M1液体发酵培养基的碳源。

2.3 不同氮源发酵M1的水提液对胃黏膜的保护作用

从表4可以看出，以牛肉膏、酵母膏和硫酸铵作为氮源时，其所培养的M1的水提液对小鼠胃黏膜损伤指数与模型对照组相比，均具有显著差异(P＜0.05)，说

明对小鼠胃黏膜具有预防性保护作用；以黄豆粉和麦麸为氮源培养的M1的水提液对小鼠胃黏膜损伤指数与模型对照组相比，没有显著性差异(P＞0.05)，对胃黏膜没有保护作用。

表4 不同氮源发酵M1的水提液对胃黏膜的保护作用Table 4 Effect of nitrogen source type on the inhibition rate of the water extract from strain M1 against grastric mucosa lesion, its biomass and extracellular polysaccharide production

从表4还可以看出，5种氮源均能作为羊肚菌M1的培养基中的氮源，其中以牛肉膏、黄豆粉、酵母膏作为氮源时，其生物量较高，分别为11.44、12.59、11.35g/L；麦麸最低，只有6.78g/L。

不同氮源对M1胞外多糖的影响表明，以硫酸铵为氮源时的胞外多糖含量最高，达到3.313mg/mL，其次为酵母膏，麦麸最小。

综合考虑，以酵母膏为氮源时，其发酵的M1的水提液对胃黏膜保护效果最好，且生物量和胞外多糖含量较高，选择酵母膏为M1液体发酵培养基的氮源。

2.4 碳、氮源正交试验结果

表5 碳、氮源正交试验结果Table 5 Complete combination design matrix and experimental results

从表5可以看出，除A1B1组合外，其余8个组合所发酵出的羊肚菌M1的菌丝体水提物均对酒精引起的小鼠急性胃黏膜损伤具有保护作用，与模型对照组比较有显著差异(P＜0.05)，其中A2B3、A3B3、A1B3、A2B2、A3B1组合对胃黏膜损伤抑制率较高，分别为81.74%、76.02%、75.81%、73.43%、71.93%，说明这5个组合对酒精引起的小鼠急性胃黏膜损伤的保护作用较好。

同时，由极差分析可知，对损伤指数而言，影响大小依次为氮源＞碳源，说明氮源对胃黏膜损伤的影响较大；对生物量、胞外多糖而言，影响大小依次均为碳源＞氮源，说明碳源对发酵的生物量、胞外多糖影响较大。

综合考虑，由于以胃黏膜保护功效为主要筛选指标，因此，选择A2B3和A3B3。但由于A3B3的生物量和胞外多糖含量要明显高于A2B3，有利于其进行液体发酵，所以确定最佳碳、氮源组合为A3B3，即可溶性淀粉2.0%，酵母膏1.5%。

3 讨论

本实验以无水乙醇致小鼠胃黏膜损伤为模型，研究不同羊肚菌的水提液对胃黏膜的保护效果，同时研究了不同羊肚菌菌株在相同PDA培养基中的生长情况，筛选获得了对小鼠胃黏膜具有保护功效和生物量较高的羊肚菌菌株M1。结果表明，不同羊肚菌菌株其发酵物水提液对胃黏膜的保护效果差异显著，可能由于菌株本身之间存在较大差异，导致其代谢产物和药用成分存在较大差异。同时不同羊肚菌菌株在相同PDA培养基中生物量差异也较大，这可能是因为不同种的羊肚菌对营养条件和环境条件的要求是不同的。

已有文献报道[16-19]不同碳、氮源对羊肚菌菌株液体发酵的生物量和胞外多糖的影响，而以药效为主要指标进行羊肚菌发酵培养基中碳、氮源的研究，目前尚未见报道。本实验以胃黏膜保护功效为主要指标，进行羊肚菌发酵培养基中碳、氮源的研究。碳、氮源单因素试验结果表明，以可溶性淀粉为碳源时，其发酵的M1的水提液对胃黏膜保护效果最好，且M1的生物量较高，可能由于可溶性淀粉含有多种酶，利于可溶性淀粉和其他成分的降解，使M1充分吸收，产生较多的次生代谢产物和活性物质；以酵母膏为氮源时，其发酵的M1的水提液对胃黏膜保护效果最好，且M1的生物量较高，可能由于酵母膏是复合氮源，含有多种营养因子，利于M1的生长和代谢，产生多种活性成分，起到对胃黏膜保护的作用。同时还表明，不同碳源对M1胞外多糖的影响较大，其中以葡萄糖为碳源时，其含量最大。引起这种差异的主要原因可能是该菌对不同糖类底物的利用率有较大差异。以果糖等物质为碳源时，胞外多

糖合成过程中需要一些活性酶的参与，这样限制了以果糖等糖类为碳源合成胞外多糖。而利用葡萄糖为碳源在胞外多糖合成过程中却不需要这些酶[20]。另外，这些碳源中葡萄糖是单糖，可直接被菌体吸收，而其他的是二糖或多糖，必须先变成单糖才能被菌体利用，故以葡萄糖作为碳源的菌体生长速度快[21]。这样可能会使以葡萄糖为碳源培养的M1在相同的发酵时间内比其他碳源培养的M1，代谢较充分，产生较多的多糖、多肽、生物碱等生理活性物质。本研究M1液体发酵物水提液中具体的对小鼠胃黏膜保护的活性物质及作用机理，还有待进一步深入的研究。

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Screening and Liquid-state Fermentation of Morchellas spp. Strain Having Gastricprotective Effect

REN Dan1,2，LUO Xia2，YU Meng-yao2，ZHENG Lin-yong1,3,4，WEI Wei1,2,4，JI Chao-hong1，GE Shao-rong1,*
(1. Key Laboratory of Bio-resources and Eco-environment, Ministry of Education, School of Life Science, Sichuan University, Chengdu 610064, China；2. Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences, Chengdu 610041, China；3. Soil and Fertilizer Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, China；4. Edible and Medicinal Fungi Expert Society in Deyang, Deyang 618003, China)

Objective: To screen a Morchellas spp. strain having gastricprotective effect and higher biomass from 9 strains, and to optimize carbon and nitrogen sources for cultivation of the screened Morchellas spp. strain. Methods: Mice were randomly divided into normal group, control group and different dose administration groups. An experimental gastric damage model was established by ethanol intragastric infusion. On the basis of selection of the optimum carbon and nitrogen sources, their optimum amounts were optimized by complete combination experiments involving three levels for achieving an optimum compromise among low lesion index and high biomass and extracellular polysaccharide production. Results: The water extract of strain M1 could significantly reduce the injury index of acute gastric mucosa lesion in ethanol-induced mice and the amount of biomass was up to 10.28 g/L. In addition, the extract exhibited the best gastricprotective effect and provided inhibition rates up to 80.92% and 53.02% against gastric mucosa damage when the carbon and nitrogen sources were soluble starch and yeast extract during liquidstate fermentation. Better gastricprotective effect and higher biomass production could simultaneously be achieved by using 2.0% soluble starch as carbon source and 1.5% yeast extract as nitrogen source. As a result, the inhibition rate against grastric mucosa lesion was 76.02% and the biomass was 8.88 g/L. Conclusion: Strain M1 has the potential to protect against gastric

Morchella escutenta；ethanol；gastric mucosa lesion；liquid-state fermentation

TQ920.1

1002-6630(2010)17-0240-05

2009-12-29

国家农业产业技术体系专项；四川省科技条件平台项目

任丹(1984—)，男，硕士研究生，主要从事食药用真菌研究。E-mail：rd7534@163.com

*通信作者：葛绍荣(1950—)，男，副教授，本科，主要从事微生物的分类鉴定与应用研究。E-mail：shaorong50@163.com

mucosa lesion, and higher biomass during liquid-state fermentation can be achieved by using 2.0% soluble starch as carbon source and 1.5% yeast extract as nitrogen source.