微生物源类胡萝卜素研究进展

赵 婷，林孔亮，惠伯棣*

(北京联合大学应用文理学院，北京 100191)

微生物源类胡萝卜素研究进展

赵 婷，林孔亮，惠伯棣*

(北京联合大学应用文理学院，北京 100191)

类胡萝卜素对人类身体健康的重要性日益受到人们关注，越来越多的类胡萝卜素功能食品走进市场。为满足人们对类胡萝卜素日益增长的需要，成本低、纯度高、更加安全的微生物源类胡萝卜素产品有逐渐替代化学合成和植物提取产品的趋势。本文对类胡萝卜素在微生物中的分布、资源、生产技术和市场潜力进行综述，为更有效地利用微生物中的类胡萝卜素资源，研发相应的生产技术，向市场提供更安全、质量更好的类胡萝卜素产品提供参考。

类胡萝卜素；微生物；微藻；转基因

大量的动物和人体血液及组织分析结果表明，人体内含有丰富的类胡萝卜素(carotenoid)。这些化合物与人体健康和降低疾病风险有关，例如控制前列腺疾病和退行性黄斑衰退症等疾病[1-2]。因此，人类需要通过食物来补充类胡萝卜素，以保证健康。但所有动物都不能自身合成类胡萝卜素，人类体内也不能合成类胡萝卜素，只能通过摄食含有类胡萝卜素的植物及低等生物或生物富集而获得类胡萝卜素。微生物作为地球上出现最早的生物，在类胡萝卜素富集的整个生物链中起着重要的作用。

几十年来，类胡萝卜素在商业上的生产，通常是利用化学合成法或从高等植物中提取，例如从番茄和红辣椒中提取的番茄红素(l y c o p e n e)和辣椒红素(capsanthin)。在自然界中，有些单细胞绿藻在一定条件下，由于高浓度次生代谢产物——类胡萝卜素的积累会变红。例如，杜氏藻(Dunaliella salina)和雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)中存在着丰富的β-胡萝卜素(β-carotene)和虾青素(astaxanthin)(图1)。

图1 β-胡萝卜素(a)和虾青素(b)的分子结构Fig.1 The molecular structures ofβ-carotene (a) and axtaxanthin (b)

大量的类胡萝卜素能够在细菌(bacteria)、酵母

(yeast)和霉菌(mould)等微生物中积累，所以这些微生物有很大的商业应用前景。在食品产业中，利用发酵获得的原料成分逐年增加。例如：增稠或胶凝剂(黄原胶、凝胶多糖、凝胶糖等)、香味剂(酵母水解物、谷氨酸钠等)、风味化合物(γ-癸内酯、丁二酮、甲酮等)和酸化剂(乳酸、柠檬酸等)等的生产[3]。发酵技术也已经大规模地用于着色剂的生产。目前有些产品已在食品产业中大量应用。例如：在欧洲，利用三孢布拉霉(Blakeslea trispora)生产β-胡萝卜素和番茄红素；在亚洲，利用红曲霉(Monascus purpureus Went)生产开环类胡萝卜素[4-5]。应用发酵法生产食品着色剂降低了产品的生产成本，与合成色素或植物提取物相比，发酵产品具有较强的市场竞争力。如果能发现或筛选出新的微生物物种，可以进一步降低类胡萝卜素产品的成本。

微生物源的类胡萝卜素产品已经可以被用作食品或饲料色素添加剂，目前正在讨论将其作为功能性食品使用的可能性[6]。本文对类胡萝卜素在微生物中的分布、资源、生产技术和市场潜力进行综述，为更有效地利用微生物中的类胡萝卜素资源，研发相应的生产技术，向市场提供更安全、质量更好的类胡萝卜素产品提供参考。

1 利用微生物生产类胡萝卜素

在现代微生物概念的范畴内，目前至少有从微藻(microalgae)、霉菌、酵母和细菌中生产类胡萝卜素产品的工业化实践的报道。尤其是从微生物中生产β-胡萝卜素的技术已经相当成熟。从微生物中生产的其他类胡萝卜素包括：番茄红素、虾青素、玉米黄质(zeaxanthin)和角黄质(canthaxanthin)。它们的分子结构见图1～2。

图2 番茄红素(a)、玉米黄质(b)和角黄质(c)的分子结构Fig.2 The molecular structures of lycopene (a), zeaxanthin (b) and canthaxanthin (c)

1.1 β-胡萝卜素

目前大规模生产β-胡萝卜素的方法主要有化学合成法和植物资源(如红棕榈油)提取法[7]。近20年来，微生物发酵法也已初具规模。在这一领域，首先应当关注的是：不同的生产方法会造成产品质量上的差异。这一差异主要集中在两个方面：1)β-胡萝卜素几何异构体组成上的差异；2)类胡萝卜素组成上的差异，尤其是生物合成中间体组成上的差异。具体差异比较见表1[8]。

表1 不同来源β-胡萝卜素产品的类胡萝卜素组成Table 1 Composition ofβ-carotene products from different sources

1.1.1 杜氏藻

虽然蓝藻属中的螺旋藻能够在体内积累数量可观的β-胡萝卜素(0.8～1.0g/100g干基)，但在生产上多采用微藻中的杜氏藻(Dunaliella salina，又名盐生杜氏藻)生产β-胡萝卜素。

杜氏藻是一种耐盐单细胞游动的绿藻，属于绿藻纲[9]。与高等植物相比具有简单快速地培养优势。在适宜的条件下，杜氏藻与其他β-胡萝卜素源相比具有很高的含量(3～5g/100g干基)，产量亦可观(400mg/m3)[10]。

杜氏藻细胞没有坚硬的细胞壁，具有杯状叶绿体，与高等植物的叶绿体相似。其生长在高盐浓度环境中，需要碳酸氢盐作为碳源。同时，还需要硝酸盐、硫酸盐和磷酸盐等其他营养物质。最初的光合生长阶段需要12～14d，需要在富含硝酸盐的培养基中；随后的类胡萝卜素形成阶段需要消耗硝酸盐，因此必须维持其盐度。杜氏藻最适合生长在富含盐和其他营养物质的沿海区域。在类胡萝卜素合成阶段中，营养物质、盐度或光的胁迫是必须满足的条件。

在最初的光合生长阶段，杜氏藻需要5～10klx光照度。而在类胡萝卜素积累阶段，光照强度应该在25～30klx的范围内。另外在高光强度下，杜氏藻会产生较大比例的顺式异构体，其中9-顺式-β-胡萝卜素可达50%[10]。据报道[11]，在一定的胁迫条件下(如高强度的光照)，杜氏藻能够大量积累β-胡萝卜素，同时又可生产丰富的蛋白质和必需脂肪酸。另据报道，杜氏藻具有多种健康功能，如抗高血压、扩张支气管、止痛、松弛肌肉和抗水肿等。

FDA已经认可杜氏藻的藻体可以直接用作食物或饲料[11]。用食用油或者是食品安全级有机溶剂从杜氏藻中提取的β-胡萝卜素可用在各种食品的配方中，例如用橄榄油和豆油提取的β-胡萝卜素可用在药物配方中。需要指出的是，在天然提取物中，通常会含有少量的其他类胡萝卜素，因此在市场上销售的产品多为混合物。

澳大利亚、中国、印度、以色列、日本和美国都是杜氏藻的主要生产地。此外，在其他几个环境条件适宜的国家也有小规模的生产。目前，市场上存在很多不同种类的杜氏藻源β-胡萝卜素产品。纯化过的β-胡萝卜素大部分以1～20g/100mL的含量分散在植物油中出售，可作为添加剂和着色剂应用。同时，也可制成软胶囊出售。一般每个胶囊含5mgβ-胡萝卜素。

1.1.2 三孢布拉霉

三孢布拉霉是一种与热带植物共生的霉菌，分正株和负株两种类型。正株合成三孢子酸，三孢子酸既是β-胡萝卜素的代谢物，又是其生物合成的调节剂。以特定比例交配两种类型的菌株，三孢子酸就能够刺激负株合成大量的β-胡萝卜素。

生产过程基本上分两个阶段：第一阶段：以葡萄糖和玉米浆作为碳源和氮源进行发酵。开始时，进行原始菌株培养，随后用有氧深层发酵来产生丰富的β-胡萝卜素；第二阶段：也称恢复阶段。在这一阶段中，菌株被分离和转化成适合提取β-胡萝卜素的形式。被分离的?-胡萝卜素可在乙酸乙酯中结晶达到适当的纯化和浓缩目的。最后的产品是β-胡萝卜素晶体或者是30g/100mL质量浓度的植物油分散体系[12]。

从三孢布拉氏霉生产β-胡萝卜素首次尝试是在1995年。通过在小鼠上进行的动物实验和对最终产品中4种真菌毒素的酶联免疫法测定，以小鼠的致病性为检测标准，已经证实三孢布拉霉没有致病性和毒性[13]。通过HPLC分析、稳定性检测和微生物检验证实了由三孢布拉霉发酵所得到的β-胡萝卜素晶体符合欧盟专家委员会在95/45/EC法规中列出的反式和顺式异构体的比例，未检出真菌毒素或其他有毒代谢物和遗传毒性等。用所产的β-胡萝卜素产品喂养大鼠28d后，未发现有害的症状。据此，欧盟委员会规定以日常饮食的5%为最高摄入剂量。欧盟科学委员会认为由三孢布拉霉发酵所得到的β-胡萝卜素与由化学合成品在做为食品着色剂时具有相当的作用。因此，可以做为食品着色剂使用[14]。

目前，在俄罗斯、乌克兰和西班牙均有由三孢布拉霉生产β-胡萝卜素的工业生产。其产品的含量已经达到30mg/g 平基或3g/L培养液[15]。

1.1.3 布拉克须霉

布拉克须霉(Phycomyces blakesleeanus)也属于真菌，也是β-胡萝卜素的一种重要来源[16]。在适宜条件下，野生型菌株中β-胡萝卜素的含量大约在0.05mg/g干基。有些突变株能够积累到10mg/g干基[17]。在工业生产中，通常使用发酵桶培养布拉克须霉[18]。

1.1.4 卷枝毛霉菌

野生型卷枝毛霉菌(Mucor circinelloides)由于积累β-胡萝卜素而显橙黄色。蓝光的诱导是其体内类胡萝卜素生物合成的必需条件[19]。卷枝毛霉菌既可以单细胞又可以菌丝体的形式生长，是二相性真菌。现在研究的重点是利用生物技术获得有用的酵母样突变株[14]。

1.2 番茄红素

番茄红素可以通过化学法合成或从番茄中提取。发酵法大规模地生产番茄红素的技术也已形成。不同的生产方法造成产品中几何异构体组成的差异见表2[20]。

表2 不同来源番茄红素的几何异构体组成Table 2 The geometrical isomer composition of lycopene from different sources%

番茄红素是β-胡萝卜素等所有双环类胡萝卜素生物合成的前提。因此，可以通过在微生物体内阻止环化反应或抑制环化酶来积累番茄红素。这种方法已经在商业生产番茄红素中应用。

1.2.1 三孢布拉霉

目前商业中已经建立了从三孢布拉霉生产番茄红素的生产工艺。在液体培养液中加入咪唑或嘧啶可抑制番茄红素环化酶[21]，使体内积累番茄红素。产品中主要是全反式番茄红素。可在产品中加入番茄红素量1%VE。产品的形态一般为20%或5%的葵花油分散体系。番茄红素油分散液可用作食品配料和食品强化剂。

根据欧洲议会和理事会关于新食品和新型食品添加剂使用的第258/97号法规，批准可在食品中使用由三孢布拉霉生产的番茄红素[22]。欧洲食品安全局评价本产品可作为食品色素使用。具体结论是：由三孢布拉霉生产的番茄红素在营养上相当于天然番茄红素，但还需要进一步的安全性实验。

1.2.2 拟枝孢镰刀菌

目前，拟枝孢镰刀菌(Fusarium sporotrichioides)已被遗传工程改造成为可以用廉价的玉米纤维(生产酒精的残渣)为原料来发酵生产番茄红素[23]。具体的过程为：借鉴于欧文氏细菌(Erwinia amylovora)的改造工作，使用多DNA序列定向克隆技术，将菌的类异戊二烯途径重新定向为通过类胡萝卜素生物合成基因合成类胡萝卜素。在实验室培养瓶中培养6d的产量是0.5mg番茄红素/g干基，目前，实验还在进一步改进中[24]。

1.3 虾青素

虾青素添加在水产养殖饲料中用以改善鱼及甲壳动

物的体色。据报道称虾青素对人类有很重要的保健功能，所以将其作为营养型食品添加剂有很大的意义。虽然化学合成虾青素仍然是市场的主导，但由微藻、酵母菌和细菌通过生物技术生产虾青素是现在深入研究的主题[25]。

1.3.1 雨生红球藻

雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)属绿藻。其体内的虾青素积累量能够达到0.2～2g/100g干基[26]。美国食品和药物管理局(FDA)已允许利用雨生红球藻生产的虾青素用于食品，几个欧洲国家也已经批准将其作为膳食补充剂。

雨生红球藻属于淡水藻，在自养和异养条件下都能生长。在户外环境中很容易受到其他不良物种的污染。其生长温度在20～28℃范围内，光照度在15klx，pH值在6.8～7.4之间。此条件下，它很容易受到细菌、真菌和原生动物的污染。所以，户外培养雨生红球藻需要尽量减少污染，适当控制光照和温度等环境条件。在培养过程中如改变物理条件和细胞的营养，可影响雨生红球藻的生长和其体内类胡萝卜素的积累。高光照强度会显著地影响其细胞的生长。可行的藻虾青素商业生产技术需要一个有效的封闭式培养系统和筛选比野生菌株耐高温的高产藻株。目前在印度、日本和美国都有成功的商业生产。近年来，人们又研究出用带有人工光照的封闭生物反应器与户外池塘联用的生产技术来培养雨生红球藻[27]。

与杜氏藻不同，雨生红球藻在生长过程中游动的鞭毛细胞变为不运动的厚壁孢子。在这些不动的孢子内会积累虾青素[28]。不动孢子内虾青素含量一般在1～2g/100g干基范围内。但在提取虾青素之前需要对其厚壁进行物理破碎[29]。

1.3.2 红法夫酵母

在能够生产虾青素的微生物中，红法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)很适合商业生产虾青素[30]，但产品是(3R，3 R)异构体(图1b)。不同营养物质(如蛋白胨、麦芽和酵母提取液等)对红法夫酵母生长的影响已经有过许多报道。同时，使用许多农副产品(如糖蜜、木材水解产物、玉米浆、甘蔗渣、甘蔗汁、葡萄汁等)作为营养物质的尝试也有不少。虾青素产量最高的培养条件是：温度19.7℃、碳源11.25g/L、pH6.0、接种量为体积分数5%。在这种条件下，虾青素的含量可达到8.1mg/L[31]。通过补料分批培养(在有限的培养基中补加培养液)的方法发现发酵方法也会影响红法夫酵母的生长和类胡萝卜素的积累。恒定pH值培养(为调整pH值而加入营养物质)条件下最高的菌株含量在17.4g/L[32]。同时，突变株的传代与优化也已经开始研究[33]。在理论层面，虾青素生物合成的途径和过程也在引起人们的关注。

在作为动物饲料时，为了提高动物肠道对虾青素的吸收率，也必须破坏发酵菌株的细胞壁。已有化学、物理、自溶和酶法破坏细胞壁的方法。关于虾青素产量的改善技术每年都有新的专利申请。目前最高的含量已经达到了3mg/g干基[34]。

1.3.3 橙黄农杆菌

虾青素是存在于橙黄农杆菌(A g r o b a c t e r i u m aurantiacum)中10种类胡萝卜素的一种。虾青素在其体内的生物合成途径已经被研究过[35]。影响其体内类胡罗卜素积累的生长条件和虾青素葡萄糖甙的产生过程已有报道，但是还没在商业应用上应用。

为了寻找新的虾青素细菌来源，人们已经进行了许多筛选工作，分离出了一些可能的目标菌株。如球菌和嗜盐杆菌[36-37]。后者尤为具有优势，因为：1)培养液中高质量浓度的氯化钠(20g/100mL)会防止其他杂菌的污染，所以不需要严格的灭菌措施；2)氯化钠在15g/100mL的质量浓度时就能够诱导细菌解体。因此，不需要特殊的细胞破碎技术，就可以对色素进行提取。提取溶媒可以直接用葵花油而不用有机溶剂。这样就消除了产品中的溶剂残留，而且加速了动物对色素的吸收。然而，这种技术还没发展为商业技术。

1.4 玉米黄质

玉米黄质能够增强鸟纲动物(如家禽)外表的黄色或者是其蛋黄的颜色[38]，可以作为着色剂应用在化妆品和食品中。同时，它还具有维持眼健康的功能。

在20世纪60年代，人们已分离出了几种能够产生玉米黄质的海生细菌。在葡萄糖或蔗糖作为碳源的培养液中培养黄杆菌(Flavobacterium sp.)能够达到生产190mg玉米黄质/L培养液的水平[39-41]，合16mg/g细胞干质量。目前很多人在研究原黄杆菌(Sphingobacterium multivorum)[42]。这一菌种用在商业产业中可大量生产玉米黄质。另一种生产玉米黄质的菌是黄质菌(Zeaxanthinifaciens)。最近，它被重新分类为副球菌种[43]。

1.5 角黄质

多年来，角黄质已被用于水产饲料中形成和增添鲑鱼、鳟鱼所需的肉色。人体过量的摄入角黄素可导致在人眼中有微小的晶体沉积。所以，角黄素作为一种食品补充剂还不能被人们接受，在水产饲料上也受到一定的限制。

一些细菌有希望用于角黄素的商业生产。有一种能够生产角黄素的慢生菌(Bradyrhizobium sp.)[44]，其合成类胡萝卜素的基因组已经被全部测出。另一种微生物是极端嗜盐古菌(Haloferax alexandrinus)。由于嗜盐古菌积累C50-类胡萝卜素，所以大部分菌体都是红色的。据报道，有些种能够合成C40-胡萝卜素以及一些酮基类胡

萝卜素。由于这些嗜盐古菌独特的功能在生物技术上有很大的应用潜力，进而给工业生产带来了极大便利。例如，培养基中极高的氯化钠浓度(15%～30%)，可以阻止其他微生物的污染，所以培养时可以不需要高压灭菌[45]。另外，因为细胞在淡水中能够发生自溶[46]，不需要细胞破碎设备。用1L的摇瓶培养，在开放的培养条件下，可生产3g干质量的物质，其中含总类胡萝卜素有6mg和2mg的角黄素[47]。

第3种细菌是戈登氏菌(Gordonia jacobea)，为革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性菌[48]。通常在常规空气采样过程中分离出体内以角黄素为主色素的粉红色菌落[49]。初次得到的野生菌落中类胡萝卜素的含量较低。但是，经过几轮的突变筛选后，可得到角黄素含量比野生菌株多6倍的突变体。通过优化培养基，可实现角黄素的含量在1～13.4mg/L之间[49]。这个突变种，从工业观点上看存在着一些潜在的优势：1)最佳的生长温度和类胡萝卜素积累温度是30℃，这是发酵罐中最易实现的温度条件；2)廉价的葡萄糖是菌体生长和色素积累的最佳碳源；3)乙醇能够直接萃取总色素的90%以上，所以，萃取物很安全[50]。

2 从转基因微生物中生产类胡萝卜素的前景

所谓代谢工程是指在活细胞内，利用重组DNA技术来修改细胞的代谢系统，使活细胞能够合成(代谢)出所需要的化学物质，并获得高产量。最理想的载体是能够自然合成所需化学物质的微生物。但能够自身合成所需化学物质前体的微生物也是很有价值的[51]。

人们已经从不同的微生物中分离出大量基因，它们能够编码类胡萝卜素生物合成所需的酶和调控类胡萝卜素的生物合成。这些基因的功能也已经被鉴定出。

一些细菌(如大肠杆菌)不能自身合成类胡萝卜素，但引入类胡萝卜素合成基因后就能够发生类胡萝卜素生物合成过程。大肠杆菌本身能够合成异戊二烯化合物(如长链醇和醌)。因此，将类胡萝卜素合成基因引入后，原有合成代谢物为类胡萝卜素的生物合成提供可行的直接碳通量。目前，由质粒携带的能够合成番茄红素、β-胡萝卜素和玉米黄质的类胡萝卜素合成基因，已经在大肠杆菌中重组和表达出。转基因细菌中积累的番茄红素、β-胡萝卜素、玉米黄质已经可以达到0.2～1.3mg/g干基的产量；实际上，除了少数如玉米黄质C(5,6)环氧化酶基因外，几乎所有的类胡萝卜素生物合成基因克隆均能够在大肠杆菌中表达[52]。

为了进一步增加类胡罗卜素合成量，对于生物技术最重要的挑战是合成过程的调控[53]。据报道，合理控制丙酮酸和甘油三磷酸的比例，番茄红素的产量可达到25mg/g干基[54]。类胡萝卜合成素基因所编码的酶活性应当存在着一个平衡调节系统。这个系统的表现应该是：在一个类胡萝卜素合成系统中，当没有中间合成代谢物池(贮存库)时，如果合成的终端产物数量减少，合成前体物的转化效率应当增加。即：这应当是一个“负反馈调节”系统。换言之，目标基因重组质粒的重要作用之一应当是减少中间物的积累，提高最终产物的产量。最后，宿主生物体应表现出极活跃的萜类合成途径和具有较高的类胡萝卜素终端产物的存储能力。

除了大肠杆菌，食用酵母、朊假丝酵母和酿酒酵母在引入类胡罗卜素基因后也具有合成类胡萝卜素的能力[55]。

现在很多分子生物学技术在这个领域中是可行的，但还有许多问题有待解决，尤其是在涉及到控制最终产品上。在许多情况下，人们的目的是获得单一的目标产物和积累高浓度的类胡萝卜素，而不是一个复杂的混合物。这使工作的难度增加很多。

3 前 景

在无尽的大自然中有非常多的微生物可以合成类胡萝卜素。在市场上消费者的接受程度、法规监管部门的批准以及把产品推向市场所需的投资影响着发酵生产的类胡萝卜素产品的最终成功。在过去很长的一段时期内，因为昂贵的发酵设施、监管机构的严格要求以及长期的毒理研究，人们对发酵法生产类胡萝卜素提出了许多质疑。然而，现在的情况已经有所好转。目前市场上已经有一些由发酵生产的类胡萝卜素产品在销售，这反映了消费者的认可程度。有理由相信，发酵法的产品在未来的市场会有一个良好的前景。

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Research Progress of Carotenoids of Microbial Origin

ZHAO Ting，LIN Kong-liang，HUI Bo-di*
(College of Applied Arts & Science, Beijing Union University, Beijing 100191, China)

The importance of carotenoids to human health is increasingly attracting people s attention. More and more carotenoid based functional foods are coming to markets. It is a tendency to progressively replace synthetic compounds and phytochemicals by low-cost, high-purity and safe products of microbial origin to meet the ever-increasing consumer demand for carotenoids. This article reviews the distribution, sources, production techniques and market potential of carotenoids of microbial origin in an effort to provide

for more effective utilization of this resource and the research and development of production techniques for safer and premium carotenoids based products.

carotenoid；microorganism；microalgae；trans-gene

TS201.24

A

1002-6630(2010)23-0461-06

2010-09-17

“十一五”国家科技支撑计划项目(2008BAI58B06)

赵婷(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为生物活性物质制备及生理功能。E-mail：zhaoting72886@163.com

*通信作者：惠伯棣(1959—)，男，教授，博士，研究方向为类胡萝卜素生物化学。E-mail：bodi_hui@ygi.edu.cn