ω-6亚油酸对小鼠免疫系统的调节作用

刘小娟，庞广昌*，李 杨

(天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134)

ω-6亚油酸对小鼠免疫系统的调节作用

刘小娟，庞广昌*，李 杨

(天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134)

目的：探索ω-6亚油酸对小鼠免疫系统的调节作用。方法：将市购的ω-6亚油酸以口服、腹腔注射、耳静脉注射3种方式作用于小鼠，分别在3、2、2h后取血分离血清，用液体芯片检测技术测定小鼠血清中的IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12(p40)、IFN-γ、G-CSF、MCP-1、VEGF等24种细胞因子含量的变化。结果：灌胃组中显著升高的细胞因子有IL-1α、Eotaxin和VEGF，显著降低的有IL-6、IL-12(p40)、G-CSF和KC；腹腔注射组中炎症细胞因子IL-1和IL-17显著升高的同时也伴随着IL-4、IL-10抗炎细胞因子的显著升高以及趋化因子G-CSF的显著降低；静脉注射组总体表现为促炎作用，IL-2、IL-5、IL-6浓度显著升高，抗炎细胞因子IL-3、IL-4、IL-9、IL-10、IL-12(p40)、IL-17浓度显著降低。结论：ω-6亚油酸能通过小鼠胃肠黏膜系统和血液系统传递信号，调节机体的免疫系统。灌胃组主要激活了PKC/NF-κB途径以及STAT的部分途径，抑制NF-κB、JAK-STAT3、PI3K途径；腹腔注射组激活的信号途径有NF-κB、JNKp38MAPK、PI3K和JAKSTAT6途径，抑制STAT3途径；静脉注射组激活的信号途径有NF-κB、MAPK和JAKSTAT3。抑制的信号途径有PI3K/ATK、ERK/MAPK、STAT1、STAT4、STAT5。

ω-6亚油酸；细胞因子；信号途径；植物非营养成分

膳食纤维中的植物非营养成分(phytochemicals)也叫植物营养素，已经成为一个热门议题，有数十类不同化学结构的植物非营养成分已经被鉴定出来，包括类胡萝卜素、植物固醇、皂苷、植酸、多酚、植物雌激素类等。许多体外实验表明植物营养素都有抗癌(作用机制主要是抑制NF-κB和MAPK信号途径)、抗氧化、降低胆固醇、抑制肠道病原菌[1]、调节免疫的作用。其中亚油酸不仅是人体不可缺少的必需脂肪酸，更重要的是它们在体内可转化为多种在人体生理活动中起着重要作用的多不饱和脂肪酸，与人体心血管疾病的控制(如能够显著影响脂蛋白代谢，从而改变心血管疾病的危险性，影响动脉血栓形成和血小板功能，影响动脉粥样硬化细胞免疫应答及炎性反应)[2]、免疫调节、细胞生长以及抗癌作用等息息相关。亚油酸衍生为花生四烯酸(AA)后，在环氧化酶和脂氧化酶的作用下，分别合成PGs2系列(前列腺素、前列腺环素和TX2)和LTs4系列(4系白三烯)。已知这些介质可以介导炎症反应[3]。花生四烯酸(AA)和前列腺素(PG)主要是与急性炎症有关。AA、PGE1(前列腺素E1)或PGE2(前列腺素E2)兔眼结膜下注射，可使眼结膜血管扩张、微血管通透性增加而致红肿，家兔或大鼠静脉或脑室内注射AA可引起体温升高[4]。

本研究使用ω-6亚油酸对小鼠通过灌胃、腹腔注射、耳静脉注射3种方式，检测其血清中24种细胞因子的浓度变化情况，探索ω-6亚油酸对细胞因子可能发挥的调节作用和作用途径，从而推测ω-6亚油酸对机体产生的免疫功能。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Bal b/c小鼠，雄性，清洁级，8～9周龄，20～25g/只，购自天津市利居生物用品供应中心。

ω-6亚油酸 天津科瑞杰生物技术开发有限公司；20～200μL，100～1000μL可调式移液器，Thermo热电(上海)仪器有限公司；DDH2O、Millipore mouse 试剂盒96孔酶标板 Millipore公司。

1.2 仪器与设备

3K15高速冷冻离心机 德国西格马实验离心机有限公司；光照生化培养箱 哈尔滨东联电子科技有限公司；Millipore液体芯片扫描仪 Millipore公司；-70℃冷冻冰箱 Sanyo公司；水平振荡器(能调温)。

1.3 方法

1.3.1 动物分组及处理

Bal b/c小鼠适应性喂养1周后，随机分成3组：口服灌胃组、腹腔注射组、静脉注射组，每组6只小鼠，包括3只实验鼠和3只空白对照小鼠。口服灌胃组亚油酸的剂量为2000μL/kg bw，腹腔注射组的剂量为800μL/kg bw，静脉注射组的剂量为400μL/kg bw，空白对照鼠给与实验鼠同等剂量同等方式的0.9%生理盐水。在实验前一天晚上禁食，口服灌胃组在服用亚油酸后3h摘除眼球取血，注射组在注射亚油酸后2h摘除眼球取血(本实验室通过给小鼠注射或者口服脂多糖LPS，系统研究了细胞因子的涨落规律，发现口服需要3～4h，注射则只有2～3h[5])，4℃、3500r/min离心15min，分离血清离心15min，分装，-20℃保存待测。

1.3.2 小鼠血清中细胞因子浓度的测定

用Millipore mouse 试剂盒检测小鼠24种细胞因子的水平。本实验检测的24种细胞因子中包括：白细胞介素类：IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-13、IL-17；干扰素类：IFN-γ；肿瘤坏死因子类：TNF-α；集落刺激因子：G-CSF、GM-CSF；趋化因子类：Eotaxin、KC、MCP-1、IP-10、MIP-1 α、RANTES、VEGF。

式中：MFI值即荧光值。

1.4 数据处理

应用SPSS11.5统计分析软件进行统计学分析。数据用平均数±标准差(x±s)表示，各组均数的比较采用方差分析，P＜0.05为有显著性差异，P＜0.01为有极显著性差异。所有柱形图、曲线图应用Excel绘制。

2 结果与分析

2.13 种方式下ω-6中的亚油酸对小鼠24种细胞因子的作用

灌胃、腹腔注射和静脉注射3种作用方式下ω-6亚油酸对小鼠24种细胞因子的作用如图1所示。

如果老年人出现突发性耳聋，可使用抗病毒和扩血管、溶栓的药物营养神经，通过吃药和输液都可以，也可以使用激素类药物减轻内耳水肿，缓解突发性耳聋。如果是由糖尿病、血管疾病等引起，就针对病因控制血糖或改善血液循环。有时游泳、沐浴时耳道进水，耳垢体积膨胀，突然感觉耳聋，只需取出栓塞即可。慢性中耳炎可导致鼓膜穿孔、炎症性肉芽肿、钙化灶等病变，须及时进行治疗。要特别提醒的是，老人出现突发性耳聋，应及时带老人到医院检查治疗，一直拖着不治疗，发展下去就会全聋，即使使用助听器也无效。

图1 3种方式下ω-6亚油酸对小鼠24种细胞因子的作用Fig. 1 Effects ofω-6 linoleic acid using three different delivery methods on 24 cytokines in mice

表1 各类细胞因子的变化(亚油酸)Table 1 Changes of cytokines in mice administered with linoleic acid

表2 统计学t检验变化显著的细胞因子(亚油酸)Table 2 Significant change of cytokines in mice administered with linoleic acid

与对照组相比各种细胞因子的变化情况见表1。在灌胃组中，IL-3、IL-4、TNF-α、IP-10在口服前后浓度没有明显变化，给小鼠口服灌胃亚油酸后，上调了IL-1α、IL-1β、IL-5、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-17、IFN-γ、Eotaxin、MCP-1、MIP-1α、RANTES、VEGF的表达量，即实验组在被检血清中的浓度高于对照组中的浓度。IL-2、IL-6、IL-12(p40)、IL-13、G-CSF、GM-CSF、KC 七种细胞因子在灌胃后，血清中的浓度低于对照组的浓度。

在腹腔注射组中，IP-10、MCP-1在注射前后浓度没有明显变化，在检测结果中，IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-9、IL-10、IL-12(p40)、IL-12 (p70)、IL-13、IL-17、IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、MIP-1α、RANTES、VEGF的浓度高于对照组中细胞因子的浓度。IL-6、Eotaxin、G-CSF、KC的浓度低于对照组。

在静脉注射组中， Eotaxin、RANTES在注射前后浓度没有明显变化，在给小鼠静脉注射亚油酸后，上调了IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-5、IL-6、TNF-α、G-CSF、KC、IP-10、MCP-1、MIP-1α、VEGF的表达量，即实验组的浓度高于对照组中细胞因子的浓度。IL-3、IL-4、IL-9、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-13、IL-17、IFN-γ、GM-CSF的浓度低于对照组。

2.2 显著性分析

应用SPSS11.5统计分析软件对实验结果进行方差t检验，根据P值进行显著分析，结果见表2。

由表2可知，在灌胃组中，VEGF与对照组相比具有极显著性差异，IL-1α、Eotaxin、VEGF的浓度显著升高，IL-6、IL-12(p40)、G-CSF、KC与对照组相比显著降低；在腹腔注射组中，IL-1α、IL-10与对照组相比具有极显著性差异，IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-10、IL-17的浓度显著升高，G-CSF与对照组相比显著降低；在静脉注射组中，IL-4 、IL-9、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-17与对照组相比具有极显著性差异，IL-2、IL-5、IL-6的浓度显著升高，IL-3、IL-4 、IL-9、IL-10、IL-12 (p40)、IL-12(p70)、IL-17与对照组相比显著降低。

3 讨 论

细胞因子是由机体免疫细胞和非免疫细胞合成和分泌的具有高效性、多功能的多肽类因子，可以作用于其他细胞受体，在分子水平上调节多种细胞的功能[6]。免疫细胞和非免疫细胞分泌的细胞因子可以作用于其他细胞的受体，在分子水平上调节多种细胞生理功能[7](表3)。它们和相应的靶细胞外膜上的受体结合，依赖于细胞和所作用的细胞因子产生某种应答。而且经常是靶细胞在细胞因子的刺激下产生另外的细胞因子。它们主要作为细胞间的信号传递分子，介导和调节机体免疫应答、细胞分化、造血、肿瘤免疫等多种生理及病理过程。总之，机体免疫应答的发生发展，以及发炎细胞因子和抗炎细胞因子之间相互作用和相互平衡构成一个复杂的网络系统[8-11]。

表3 几种显著变化的细胞因子的生物功能及其介导的信号途径Table 3 Functions and signal pathways of cytokines with significant change

腹腔注射组没有经过胃肠道，是直接对肠黏膜系统发挥作用的。炎症细胞因子IL-1和IL-17升高的同时也伴随着IL-4、IL-10抗炎细胞因子的升高以及趋化因子G-CSF的降低，亚油酸作用于腹腔内的共同黏膜免疫系统(common mucosal immunity system，CMIS)时[15]，肠道上皮细胞(M细胞)、淋巴细胞、巨噬细胞、抗原呈递细胞、NK细胞等发出炎症信号产生一系列相应的细胞因子，如本研究中的IL-1、INF-γ等，接着，胞内一系列转录因子磷酸化和去磷酸化(表3)使这些细胞因子的信号被放大，促进Th0向Th2细胞极化，分泌IL-4、IL-10等抗炎细胞因子来中和过高的炎症反应。说明随着时间的延长，机体会产生抗炎细胞因子来平衡过高的炎症，激活的信号途径有NF-ΚB、JNKp38MAPK、PI3K和JAKSTAT6途径，抑制STAT3途径。

静脉注射组是避开肠胃道及黏膜系统直接进入血液作用于小鼠的，总体表现为促炎作用。IL-2、IL-5、IL-6浓度显著升高，抗炎细胞因子IL-3、IL-4、IL-9、IL-10、IL-12(p40)、IL-17浓度显著降低。激活的信号途径有NF-κB、MAPK、和JAKSTAT3。抑制的信号途径有PI3K/ ATK、ERK/MAPK、STAT1、STAT4、STAT5，可能是由于亚麻酸除了能通过旁分泌参与免疫反应外还能影响静脉中的一些蛋白因子，形成更复杂的关系。有文献[16-17]表明亚油酸能抑制血小板活化因子(PAF)的产生(PAF由单核细胞产生，活化血小板，促进动脉粥样硬化形成)；抑制血小板衍生生长因子(PDGF)(PDGF能导致动脉血管壁平滑肌细胞、纤维细胞、巨噬细胞的迁移和增加)；降低极低密度脂蛋白VLDL(VLDL是心血管病的危险因素)；抑制脂蛋白(α)(LP(α))的产生(LP(α)有致动脉粥样硬化形成和血栓形成作用，它的载脂蛋白分子结构与纤维蛋白溶酶原很相似，是纤维蛋白溶酶原活化剂的抑制剂，使纤维蛋白不易溶解)。

4 结 论

灌胃组中大部分白介素类细胞因子没有显著性变化，趋化因子的变化情况比较显著。IL-1α、Eotaxin和VEGF的浓度显著性升高，IL-6、IL-12(p40)、G-CSF和KC浓度显著降低。亚油酸在经过胃肠道消化吸收后，与肠黏膜上的上皮细胞受体结合，激活了PKC/NF-κB途径以及STAT的部分途径促进IL-α、Eotaxin和VEGF的表达，对NF-κB、JAK-STAT3、PI3K途径的抑制可能导致IL-6、IL-12(p40)、G-CSF和KC浓度的降低。腹腔注射组中炎症细胞因子IL-1和IL-17升高的同时也伴随着IL-4、IL-10抗炎细胞因子的升高以及趋化因子G-CSF的降低，说明随着时间的延长，机体会产生抗炎细胞因子来平衡过高的炎症，激活的信号途径有NF-κB、JNKp38MAPK、PI3K和JAKSTAT6途径，抑制STAT3途径。静脉注射组总体表现为促炎作用。IL-2、IL-5、IL-6浓度显著升高，抗炎细胞因子IL-3、IL-4、IL-9、IL-10、IL-12(p40)、IL-17浓度显著降低。激活的信号途径有NF-κB、MAPK、和JAKSTAT3。抑制的信号途径有PI3K/ATK、ERK/MAPK、STAT1、STAT4、STAT5。

有研究表明不饱和脂肪酸(PUFA)在组织培养中能抑制3种腹水癌的生长，对淋巴肉瘤也有很好的抑制作用，其中以亚油酸与亚麻酸的作用最强，大剂量(100～200mg/kg)的亚油酸腹腔注射，可以完全抑制肉瘤S37的生长，并使小鼠淋巴细胞性白血病(腹水型)小鼠的存活时间延长[18]。本实验主要研究口服ω-6亚油酸后对机体免疫系统的作用，辅以小剂量的腹腔注射和静脉注射方式作为对照(亚油酸是一种脂溶性物质，注射剂量要在风险范围之内)，相对于静脉注射组表现出的显著促炎作用，口服途径对机体的作用就表现得相对均衡，可见口服ω-6亚油酸是一种安全科学的方式，它不仅作为食物给机体提供了必需的营养，最重要的是它能通过肠黏膜系统传递信息从而调节机体的免疫活动。在营养相对过剩的今天我们还是希望合理饮食，不要过分追求食用所谓增强免疫的食品。最好不要通过注射的形势给机体所谓“免疫增强”食品，本研究的结果表明服用过多的ω-6亚油酸反而可能会降低食欲，增加机体过头的炎症应答。

[1]LAPARRA J M, SANZ Y. Interactions of gut microbiota with functional food components and nutraceuticals[J]. Pharmacological Research, 2009, 11: 1-5.

[2]刘步明. 多不饱和脂肪酸在肿瘤防治中的应用[J]. 陕西师范大学学报, 1996, 24(1): 45-47.

[3]校宏兵, 曹伟新, 尹浩然. 全肠道外营养脂肪能源的选择和应用[J].中国临床营养杂志, 1996, 4(4): 172-173.

[4]陈琼华. 多不饱和脂肪的生化、生理、病理和药理[J]. 南京药学院学报, 1982, 18(1): 63-65.

[5]庞广昌, 于立芹, 郭丽. 食品发挥非营养生物功能的胃肠黏膜信号通路[J]. 食品科学, 2009, 30(19): 322-326.

[6]MANSON W, ANNAN W D. The structure of a phosphopeptide derived from casein[J]. Arch Biochem Biophys, 1971, 145(1): 16-26.

[7]庞广昌, 陈庆森, 胡志和. 食品是如何通过细胞因子网络控制人类健康的[I][J]. 食品科学, 2006(5): 258-264.

[8]HADDADA J J. Interleukin-10 and the regulation of mitogen-activated protein kinases: are these signaling modules targets for the anti-inflammatory action of this cytokine? [J]. Cellular Signalling, 2003, 15: 255-267.

[9]KASAI T, INADA K, TAKAKUWA T, et al. Anti-inflammatory cytokine levels in patients with septic shock[J]. Res Commun Pathol Pharmacol, 1997, 98: 34-42.

[10]STASI R, ZINNANI P L, GALIENI P, et al. Clinical imp lications of cytokine and soluble receptor measurements in patients with newly diagnosed agressive non-Hodgkin slmphomal[J]. Eur J Haematal, 1995, 54: 9-17.

[11]PLATA-SALAMAN C R. Cytokines and ingestive behavior: methodsand overview[C]//de SOUZA E B. Neurobiology of ytokines: methods in neurosciences. New York: The New York of Science, 1993, 17: 151-169.

[12]THOMSON A W, LOTZE M T. The cytokine handbook[M]. 4th ed. Amsterdam: Academic Press, 2003.

[13]Cytokines & Cells Online Pathfinder Encyclopedia [DB/OL][2010-07-20]. http://www.copewithcytokines.de.

[14]赵玉峰, 装建明, 朱运龙. 亚油酸通过双信号途径激活大鼠胰岛p细胞上ATP敏感性钾通道[C]//2008年神经内分泌暨神经免疫内分泌学术研讨会. 中国云南大理: 中国生理学会消化内分泌生殖代谢生理专业委员会、中国神经科学会神经免疫专业委员会和中国解剖学会神经解剖专业委员会, 2008: 22-23.

[15]WANG D, CHRISTOPHER M E, NAGATA L P, et al. Intranasal immunization with liposome-encapsulated plasmid DNA encoding influenza virus hem agglutinin elicits mucosal, cellular and humoral immune responses[J]. J Clin Virol, 2004, 31(1): 99-106.

[16]齐婕, 尹桂香, 罗红. 植物油多不饱和脂肪酸对机体健脑作用的研究[J]. 北华大学学报: 自然科学版, 2008, 8(4): 329-331.

[17]郑建仙. 功能性食品[M]. 北京: 中国轻工业出版社, 1999: 153-195.

[18]顾学裘. 中国月见草油对抗癌、抗衰老、保健食疗的研究[J]. 医药导报, 1997, 16(1): 3-5.

Regulatory Function of ω-6 Linoleic Acid on Mouse Immune System

LIU Xiao-juan，PANG Guang-chang*，LI Yang
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Objective: To explore the effect of ω-6 linoleic acid on cytokines of mice. Methods: The mice were administered with linoleic acid by intragastric administration, intraperitoneal injection and vein injection respectively. At 3, 2 h and 2 h after administration, the concentration changes of 24 cytokines including IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12 (p40), IFN-γ, G-CSF, MCP-1 and VEGF in mouse serum were determined. Results: An obvious increase in IL-1, Eotaxin and VEGF, and significant decline in IL-6, IL-12 (p40), G-CSF and KC were observed in mice with intragastric administration of ω-6 linoleic acid; In intraperitoneal injection group, the concentration of IL-1, IL-17, IL-4, IL-10 exhibited an obvious increase, whereas GCSF exhibited an obvious decrease; The mice in vein-injection group showed a remarkable change with inflammation, which exhibited a dramatic increase of IL-2, IL-5 and IL-6, and a significant decrease of IL-3, IL-4, IL-9, IL-10, IL-12 (p40), and IL-17. Conclusion: ω-6 linoleic acid can transfer signal through mucosal immunity of intestine and blood system to regulate immune system. In intragastric administration group, PKC/NF-κB and partial STAT pathways can be activated and JAK-STAT3 and PI3K pathways can be inhabited; in intraperitoneal injection group, NF-κB, JNK/p38/MAPK, PI3K and JAK/STAT6 can be activated and STAT3 can be inhabited; in vein-injection group, NF-κB, MAPK and JAK/STAT3 can be activated, and PI3K/ATK, ERK/MAPK and STAT1, 4, 5 can inhabited. Nowadays, due to excessive nutrition for some people, it is not scientific strategy for these people to pursue immune-enhancing food, which can keep their body in a continuous inflammation status. Therefore, our health should be result from a dietary structure that is benefit for immune balance.

ω-6 protein；cytokine；signal pathway；phytochemicals

Q178.535

A

1002-6630(2010)23-0375-05

2010-09-25

国家自然科学基金项目(30871951)

刘小娟(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为生物活性物质的分离纯化。E-mail：llxjj1236@163.com

*通信作者：庞广昌(1956—)，男，教授，博士，研究方向为食品生物技术及食品免疫学。E-mail：pgc@tjcu.edu.cn