富锗大麦苗体内外抗肿瘤作用

杜 蓉，王晓洁,*，许 清，阮 新，刘新生，曲彦清，杨立红，肖颜颜

(1.鲁东大学生命科学学院，山东 烟台 264025；2.烟台出入境检验检疫局，山东 烟台 264000；3.鲁东大学校医院，山东 烟台 264025)

富锗大麦苗体内外抗肿瘤作用

杜 蓉1，王晓洁1,*，许 清1，阮 新2，刘新生3，曲彦清3，杨立红1，肖颜颜1

(1.鲁东大学生命科学学院，山东 烟台 264025；2.烟台出入境检验检疫局，山东 烟台 264000；3.鲁东大学校医院，山东 烟台 264025)

目的：研究富锗大麦苗的体内外抗肿瘤作用。方法：建立小鼠S-180肉瘤模型，富锗大麦苗连续灌胃12d，观察其对荷瘤小鼠瘤质量、胸腺指数和脾脏指数的影响；同时采用MTT法研究富锗大麦苗体外对小鼠S-180肉瘤细胞及小鼠SP-2骨髓瘤细胞增殖抑制作用。结果：富锗大麦苗高剂量组可明显抑制小鼠体内S-180肉瘤的生长(P＜0.05)，抑瘤率为68.52%，且明显提高小鼠的胸腺指数和脾脏指数(P＜0.05)；富锗大麦苗具有明显的抑制小鼠S-180肉瘤细胞及小鼠SP-2骨髓瘤细胞体外增殖的作用，且与富锗剂量呈正相关。结论：富锗大麦苗在体内和体外都有明显的抑制肿瘤增殖的作用。

富锗大麦苗；S-180瘤株；SP-2瘤株；小鼠

关于大麦苗营养的利用，《本草纲目》早有记载。近年研究发现大麦苗的蛋白质含量明显高于籽粒[1]，新鲜的麦苗富含活性矿物质、维生素、酶等，可消除氧自由基，分解体内毒素，达到抗衰老、消除医药品公害、消除重金属富集，预防癌症[2]的功效。

锗的化合物分为有机锗和无机锗两种，无机锗对人体有一定的毒副作用，而有机锗具有广泛的调节机体免疫力、保肝、抗肿瘤[3]、抗衰老以及抗氧化的作用。本研究采用生物富集锗的方法[4]，利用价廉的大麦苗作为富锗对象，将无机锗转化为有机锗，以期达到大麦苗和有机锗的双重功效。富锗大麦苗对于小鼠免疫功能的免疫调节作用以及保肝作用已经得到实验验证[5]。本实验通过建立小鼠S-180肉瘤动物模型，观察富锗大麦苗体内抗肿瘤的作用；以小鼠S-180，SP-2细胞株为对象采用MTT比色法来研究富锗大麦苗的体外抗肿瘤作用，为进一步研究和开发其营养价值提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

健康昆明种小鼠36只，雌性，体质量20～30g，由山东绿叶制药有限公司动物房提供，实验动物生产许可证号：SCXK(鲁)20090009；鼠肉瘤细胞S-180(S-180)瘤株由上海细胞所提供；鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14(SP-2)瘤株由武汉细胞保藏中心所提供。

二氧化锗(AR) 国药集团化学试剂有限公司；二甲基亚砜(DMSO)(AR) 天津市科密欧化学试剂开发中心；四甲基偶氮唑兰(MTT) Sigma公司；RPMI 1640 Gibco公司； 胎牛血清(FBS) 生工生物工程(上海)有限公司；生理盐水；5-氟尿嘧啶(5-FU)。

超净工作台；CO2恒温培养箱；酶标仪；96孔细胞培养板；针式直径2.5cm微孔滤膜滤器。

1.2 方法

1.2.1 大麦苗汁的制备[4]

采用水培法和不同的富锗方法，筛选出浸麦富锗质量浓度为80mg/L(有机锗含量为4.05μg/g）的大麦苗进行大批量培育[4]。将收割的富锗大麦苗按照每100g加100mL生理盐水，研磨，过滤，配成1g/mL的富锗大麦苗原汁，另稀释为0.5、0.1g/mL，同样方法配制1g/mL的正常大麦苗汁，现配现用。

1.2.2 富锗大麦苗对荷S-180肉瘤小鼠抗肿瘤作用

1.2.2.1 动物分组及给药

将小鼠随机分为对照组，富锗大麦苗低、中、高剂量组(简称富锗低、中、高剂量组)，正常大麦苗组，5-FU组共6组，每组6只。富锗低、中、高剂量组灌药质量浓度分别为0.1、0.5、1g/mL，正常大麦苗组为1g/mL，5-FU组288μg/mL[6]作为抗肿瘤阳性对照。实验组每天灌胃一次，每次0.2mL，连续12d，对照组给予等量的生理盐水。各组小鼠自由饮食、饮水。12d后每只小鼠于左前肢腋下接种S-180瘤细胞悬液(3×106个/mL)0.1mL，继续灌胃12d后停药。5-FU组接种S-180，3d后开始灌服5-FU，方法同上，共3d。

1.2.2.2 抑瘤率、胸腺指数及脾脏指数的测定

末次给药24h，称质量后颈椎脱臼处死小鼠，取瘤块、胸腺、脾脏称质量，计算抑瘤率[7]、胸腺指数[8]、脾指数。

1.2.3 富锗大麦苗对S-180、SP-2细胞增殖的抑制作用

分别常规接种S-180、SP-2细胞于含10%FBS的RPMI 1640培养液中，37℃、5%CO2饱和湿度的条件下培养。采用MTT比色法[9]测定细胞增殖抑制率：取对数生长期的细胞，用含10% FBS的RPMI 1640培养液配成密度为2×105个/mL的细胞悬液，接种于96孔培养板，每孔100μL。实验分为对照组，富锗低(0.1g/mL)、中(0.5g/mL)、高剂量组(1.0g/mL)，正常麦苗组(1.0g/mL)和5-FU组(288μg/mL)6组，每组设6个复孔。各组分别按要求加入麦苗汁或5-FU 100μL，对照组加入等量的培养液，常规培养24h。实验用麦苗汁和5-FU均经过0.45μm微孔滤膜过滤除菌。24h后，每孔加入20μL 5mg/mL MTT溶液，继续培养4h，终止培养，弃去孔内上清。每孔加入150μL DMSO，摇床振荡10min，用酶标仪测波长490nm处OD值。

式中：OD1为对照组平均OD值；OD2为实验组平均O D值。

1.2.4 统计学处理

所有数据均采用x±s表示，数据采用SPSS16.0统计分析软件进行处理，两两比较采用t检验。

2 结果与分析

2.1 富锗大麦苗体内抗肿瘤作用

2.1.1 富锗大麦苗对荷S-180肉瘤小鼠体质量和瘤质量的影响

表1 富锗大麦苗对荷S-180肉瘤小鼠体质量和瘤质量的影响(±s)Table 1 Effect GEBS on body weight and tumor weight of mice with S-180 sarcoma±s)

表1 富锗大麦苗对荷S-180肉瘤小鼠体质量和瘤质量的影响(±s)Table 1 Effect GEBS on body weight and tumor weight of mice with S-180 sarcoma±s)

注：a.与对照组比较，差异极显著(P＜0.01)；b.与对照组比较，差异显著(P＜0.05)；d.与5-FU组比较，差异显著(P＜0.05)。

组别 动物数 体质量/g瘤质抑瘤始终始终量/g率/%对照组66 30.31±0.5134.00±0.470.54±0.06—富锗低剂量组66 28.87±0.3834.30±0.370.46±0.0414.81富锗中剂量组66 29.22±0.3733.98±0.570.25±0.01a53.70d富锗高剂量组66 29.25±0.4933.03±0.670.17±0.01a68.52d正常大麦苗组65 29.20±0.4832.78±0.370.18±0.09a66.67d5-FU组64 29.48±0.4933.13±0.640.33±0.03b38.89

如表1所示，给药12d后各组小鼠体质量与给药前比较均有所增加，但组间比较无明显差异。说明富锗

大麦苗对荷瘤小鼠的体质量变化无明显影响。与对照组比较，富锗低剂量组瘤质量无明显变化，其他各组瘤质量明显降低(P＜0.05)。富锗低、中、高剂量组的抑瘤率分别为14.81%、53.70%、68.52%，正常大麦苗组抑瘤率为66.67%，5-FU组抑瘤率为38.89%；富锗中、高剂量组以及正常大麦苗组的抑瘤率均高于5-FU组(P＜0.05)。

2.1.2 富锗大麦苗对荷S-180肉瘤小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响

表2 富锗大麦苗对荷S-180肉瘤小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响(±s,n=6)Table 2 Effect GEBS on thymus index and spleen index of mice with S-180 sarcoma±s,n=6)

表2 富锗大麦苗对荷S-180肉瘤小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响(±s,n=6)Table 2 Effect GEBS on thymus index and spleen index of mice with S-180 sarcoma±s,n=6)

注：b.与对照组比较，差异显著(P＜0.05)

组别胸腺质量/mg胸腺指数/(mg/g)脾脏质量/mg脾脏指数/(mg/g)对照组106.77±10.653.14±0.31166.88±2.294.88±0.08富锗低剂量组121.28±8.093.54±0.28163.99±8.944.75±0.22富锗中剂量组85.50±7.682.52±0.25169.52±4.225.00±0.16富锗高剂量组156.60±15.48b4.75±0.45b203.17±2.16b6.15±0.12b正常大麦苗组111.76±6.523.41±0.19199.96±6.76b6.07±0.22b5-FU组94.70±13.362.86±0.41152.43±11.164.59±0.31

如表2所示，与对照组相比，富锗高剂量组胸腺质量和胸腺指数均有明显提高(P＜0.05)；富锗高剂量组、正常大麦苗组的脾脏质量和脾脏指数较对照组都有显著提高(P＜0.05)。

2.2 富锗大麦苗体外抗肿瘤的作用

2.2.1 富锗大麦苗体外对S-180细胞增殖的抑制作用

表3 富锗大麦苗对小鼠S-180细胞增殖的影响(±s,n=6)Table 3 Effect GEBS on cell proliferation in mice with S-180 sarcoma±s,n=6)

表3 富锗大麦苗对小鼠S-180细胞增殖的影响(±s,n=6)Table 3 Effect GEBS on cell proliferation in mice with S-180 sarcoma±s,n=6)

注：a.与对照组比较，差异极显著(P＜0.01)；b.与对照组比较，差异显著(P＜0.05)；c.与正常大麦苗组比较，差异显著(P＜0.05)；d.与5-FU组比较，有显著性差异(P＜0.05)。下同。

组别OD490nm生长抑制率/%对照组0.88±0.04—富锗低剂量组0.60±0.05bd31.42d富锗中剂量组0.27±0.04bcd69.32cd富锗高剂量组0.01±0.02ac98.90c正常大麦苗组0.56±0.03bd36.46d5-FU组0.03±0.05a96.10

如表3所示，富锗低、中、高剂量组均能抑制S-180细胞的增值，其抑制率分别为31.42%、69.32%、98.90%，且与剂量呈正相关。正常大麦苗组抑制率为36.46%，其明显低于富锗中、高剂量组(P＜0.05)；富锗高剂量组的抑制率能达到5-FU组的水平，其余各组均低于5-FU组(P＜0.05)。

2.2.2 富锗大麦苗体外对SP-2细胞增殖的抑制作用

表4 富锗大麦苗对小鼠SP-2细胞增殖的影响(±s,n=6)Table 4 Effect GEBS on cell proliferation in mice with SP-2 sarcoma (±s,n=6)

表4 富锗大麦苗对小鼠SP-2细胞增殖的影响(±s,n=6)Table 4 Effect GEBS on cell proliferation in mice with SP-2 sarcoma (±s,n=6)

组别OD490nm生长抑制率/ %对照组0.70±0.01—富锗低剂量组0.56±0.02bd20.37d富锗中剂量组0.24±0.02bcd66.4cd富锗高剂量组0.02±0.01ac97.68c正常大麦苗组0.52±0.02bd26.69d5-FU组0.03±0.03a95.39

如表4所示，富锗低、中、高剂量组均能抑制S-180细胞的增值，其抑制率分别为20.37%、66.4%、97.68%，且与剂量呈正相关。正常大麦苗组抑制率为26.69%，其明显低于富锗中、高剂量组(P＜0.05)；富锗高剂量组的抑制率能达到5-FU组的水平，其余各组均低于5-FU组(P＜0.05)。

3 讨 论

自富锗保健品的开发和利用在国内开始流行，富锗产品抗肿瘤作用及其机制的研究一直是热点。本实验采用小鼠肉瘤S-180肿瘤模型进行体内抗肿瘤实验及小鼠肉瘤S-180株、骨髓瘤SP-2株进行体外筛选，初步证明了富锗大麦苗对S-180、SP-2瘤株体内外生长有抑制作用。

体内抗肿瘤实验结果显示：富锗中、高剂量组以及正常大麦苗组对小鼠体内S-180实体瘤有明显的抑制作用，效果优于5-FU组(这不排除，可能5-FU用量不足而致，牛高华等[10]研究5-FU的体内用量为20mg/kg，因本实验组体内用量是按体外实验用量定的，所以，5-FU也按体外实验用量设定(288μg/mL，每只0.2mL)，由此可见，此量和临床5-FU体内用量相比低很多)，且富锗高剂量组可显著提高了荷瘤小鼠的胸腺指数和脾脏指数，正常大麦苗组能明显提高荷瘤小鼠的脾脏指数。胸腺指数和脾脏指数的提高提示富锗大麦苗和正常大麦苗组可能通过增强宿主免疫功能而达到抗肿瘤的效果。通过本实验已证明富锗大麦苗能够明显提高小鼠机体的细胞免疫和体液免疫[5]；有机锗能诱使人体细胞产生细胞介素和干扰素[11]，同时可能会刺激T淋巴细胞产生淋巴因子，活化巨噬细胞及激活NK活性，从而发挥杀伤肿瘤细胞的作用[12]，富锗麦苗抗肿瘤作用可能是大麦苗本身和麦苗中有机锗的联合作用的结果。5-FU是一种常用的抗肿瘤化疗药，其主要是直接抑制肿瘤的生长，本实验也证明5-FU并没有提高胸腺指数和脾脏指数的作用。富锗高剂量组和正常大麦苗组对小鼠体内S-180实

体瘤有明显的抑制作用，效果优于5-FU组，这提示体内抗肿瘤主要是通过提高机体的免疫力达到抗肿瘤的作用，但也不排除，因本实验使用5-FU时间和实验组不同步，只用了3d所致，因为前期研究发现5FU随使用时间加长，其抑瘤率增加的同时其毒副作用也增加，出现实验动物明显消瘦和死亡。因而本实验选用3d，即出现了其抑瘤作用与毒副作用都不明显。以上提示：肿瘤病人化疗期间，在使用一般化疗药物时最好同时配合使用提高机体免疫力的药物，才能达到更好的效果。

本研究进行体内抗肿瘤实验，是先采取实验组提前灌胃12d，然后造肿瘤模型再继续灌胃12d，目的是先激活机体的免疫系统，使其抗肿瘤效果更好。前期研究也曾造模同时进行灌胃，但抑瘤率只能达到30%左右，这提示用富锗大麦苗抗肿瘤应作为辅助物使用，因其作用发挥较慢，并且需要达到一定的剂量和时间才能达到预期的效果。

体外实验结果显示，富锗大麦苗对小鼠肉瘤S-180细胞、小鼠骨髓瘤SP-2细胞增殖均有明显的抑制作用，且随着富锗质量浓度的升高抑制作用加强，表现出一定的量效关系。富锗中、高剂量组效果明显优于正常麦苗组，且高剂量组效果能达到5-FU组的水平。通过体外实验证明富锗大麦苗对肿瘤细胞有直接抑制作用，其对肿瘤细胞直接抑制作用可能是有机锗的作用，有研究表明有机锗-132(β-羧乙基锗三氧化物)和螺锗(8,8-二烷基-2-氮杂-8-锗杂螺癸烷)抑制肿瘤活性的可能机制包括增强机体免疫力，清除自由基和抗突变等多个方面，许多生物活性的有机锗化合物分子中与锗原子配位的通常是氧、硫和氮之类的强电负性原子，由于它们对电子的吸收作用导致锗原子周围的电子云偏离原子核而形成一个正电中心，当有机锗化合物遇到肿瘤细胞时，其正电中心可增加肿瘤细胞的电势能，降低其活动能力，从而起到抑制和杀死肿瘤细胞的作用，这就是有机锗化合物抑制肿瘤活性的生物电位学说[13]。任迎春等[14]证明双β-羧己基锗氢氧化物可抑制肝癌细胞的分裂，形成大量的裸核，而锗-132则无明显的抑制肝癌细胞分裂的作用。因而，不同的有机锗，可能抗肿瘤的作用机制有所不同，并且对不同的肿瘤细胞也可能作用不同。本实验富锗大麦苗对两种小鼠瘤细胞(一种是实体瘤细胞肉瘤S-180，一种骨髓瘤SP-2)作用效果一样，这说明富锗大麦苗对分裂周期较快的细胞均有抑制作用，其可能对细胞分裂某个周期有抑制作用，有待继续探究。

本研究结果表明，富锗大麦苗在体内和体外均有明显的抑制肿瘤的作用，且本实验中其没出现任何毒副作用，认为富锗大麦苗是一种很好的口服抗肿瘤辅助物。但其对肿瘤细胞生长周期的抑制作用以及大麦苗的中的有机锗是以何种结合形式存在还有待深入研究。

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in vitro Anti-tumor Effect of Germanium-riched Barley Seedling

DU Rong1，WANG Xiao-jie1,*，XU Qing1，RUAN Xin2，LIU Xin-sheng3，QU Yan-qing3，YANG Li-hong1，XIAO Yan-yan1
(1. College of Life Science, Ludong University, Yantai 264025, China；2. Yantai Entry and Exit Inspection and Quarantine Bureau, Yantai 264000, China；3. College Hospital, Ludong University, Yantai 264025,China)

Objective: To investigate the anti-tumor effect of Germanium-enriched barley seedling (GEBS) in vivo and in vitro. Methods: The S-180 model mice were administered with GEBS at different dosages by gavage for 12 consecutive days. The effect of GEBS on tumor weight, thymus index and spleen index of mice was explored. Meanwhile, the inhibition effect of GEBS on the proliferation of mouse sarcoma cell S-180 and myeloma cell SP-2 was also evaluated by MTT assay. Results: GEBS with high dosage could obviously suppress the growth of S-180 sarcoma in mice with an inhibition rate of 68.52% (P＜0.05) and increase the thymus index and spleen index (P＜0.05). Moreover, GEBS could obviously inhibit the growth of mouse sarcoma cell S-180 and myeloma cell SP-2 in vitro in a positive dosage-dependent manner. Conclusion: GEBS can obviously inhibit the growth of tumor in vivo and in vitro.

germanium-rich barley seedling；sarcoma S-180；myeloma SP-2；mice

TS201.2

A

1002-6630(2010)23-0371-04

2010-08-27

烟台市科学技术发展计划项目(2007152)

杜蓉(1984—)，女，硕士研究生，主要从事动物免疫学研究。E-mail：xiaowu_5533@163.com

*通信作者：王晓洁(1962—)，女，教授，博士，主要从事动物生理学及免疫学研究。E-mail：wxj10304@126.com