甘草苷抗脑缺血再灌注炎性损伤研究

孙雅煊，刘 婷，戴雪伶，高兆兰，魏 荣，郑秋生

(1.北京联合大学应用文理学院，北京 100191；2. 中国科学院寒区旱区环境与工程研究所，甘肃 兰州 730000；3. 石河子大学药学院，新疆 石河子 832003)

甘草苷抗脑缺血再灌注炎性损伤研究

孙雅煊1,2，刘 婷3，戴雪伶1，高兆兰1，魏 荣1，郑秋生3

(1.北京联合大学应用文理学院，北京 100191；2. 中国科学院寒区旱区环境与工程研究所，甘肃 兰州 730000；3. 石河子大学药学院，新疆 石河子 832003)

目的：探讨甘草苷抗小鼠脑缺血再灌注炎性损伤作用及机制。方法：将ICR小鼠随机分为假手术组、模型组、阳性对照组(依达拉奉3mg/(kg bw·d)和甘草苷高、中、低剂量(40、20、10mg/(kg bw·d))组。采用线栓法建立局灶性脑缺血再灌注损伤模型，缺血2h再灌注22h后，观察脑组织病理学变化、测定髓过氧化物酶(MPO)活性，检测细胞间黏附因子-1(ICAM-1)表达。结果：与模型组相比，甘草苷可明显减轻脑组织病理学改变，降低MPO活性及ICAM-1表达。结论：甘草苷具有抗脑缺血再灌注炎性损伤活性。

甘草苷；脑缺血再灌注；炎性损伤；髓过氧化物酶；细胞间黏附因子-1

脑缺血是一种具有发病率高、致残率高、致死率高、复发率高等特点的脑血管疾病，而脑血管疾病与癌症、心脏病一并构成人类三大死亡原因[1-3]。目前，已有多种溶栓药物被用于脑缺血治疗，但伴随着溶栓治疗的进展，强烈需求适合于抗脑缺血再灌注损伤药物，以遏制再灌注所引起的脑组织的进一步损伤[4]。研究表明脑缺血再灌注损伤与炎症反应、氧化应激、钙超载、细胞凋亡等有关，其中炎症反应是研究热点之一[5-6]。甘草中多种活性物质被证实具有抗脑缺血再灌注损伤作用，但甘草中另一活性成分——甘草苷，虽已有研究表明其具有抗氧化、抗抑郁、护肝、神经及心脏保护等活性[7-12]，然而目前尚无有关其抗脑缺血再灌注炎性损伤研究报道。

本实验拟采用线栓法制备小鼠大脑中动脉栓塞模型，研究甘草苷对脑缺血再灌注炎性损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

雄性ICR小鼠，体质量25～28g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2007-001。自然光照周期饲养，术前12h禁食，自由饮水。

甘草苷(纯度≥98%) 天津尖峰天然产物公司；依达拉奉 南京先声东元制药有限公司；髓过氧化物酶(MPO)测试盒 南京建成生物工程研究所；细胞间黏附

分子-1(ICAM-1)抗体 北京博奥森生物技术有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

IX51倒置显微镜 日本奥林巴斯公司；多功能酶标仪 Sigma公司；TGL 16M离心机湖南凯达科学仪器有限公司；涡旋混合器 金坛市医疗器械厂。

1.2 方法

1.2.1 动物分组

ICR小鼠随机分为假手术组、模型组、 阳性对照组(依达拉奉3mg/(kg bw·d))和甘草苷高、中、低剂量(40、20mg/(kg bw·d)和10mg/(kg bw·d)组，每组8只。其中假手术组和模型组均灌胃给予等体积的0.5%的羧甲基纤维素钠。各组动物均于手术前连续给药3d，每天1次，第3天给药1h后采用线栓法制备小鼠大脑中动脉栓塞模型。

1.2.2 脑缺血再灌注模型制备

将小鼠用4g/100mL水合氯醛(400mg/(kg bw·d))麻醉后，仰卧固定，常规消毒，沿颈部中线切开皮肤，分离皮下筋膜及肌肉组织。手术显微镜下分离左侧颈总动脉(CCA)及其颈内动脉(ICA)和颈外动脉(ECA)。根部结扎ECA，夹闭CCA和ICA。在CCA上开一小口，将鱼线沿着CCA，穿过ICA和ECA分叉处进入ICA。松开ICA，继续将鱼线插入到ICA颅内段。自ICA起始部的插入长度约为1.2cm，表明线的头端已穿过大脑中动脉起始部，结扎CCA和ICA。术中白炽灯加温，维持小鼠肛温约37℃。术后缝合伤口，动物回笼。缺血2h后拔出线栓至ECA和ICA分叉处，实现再灌注。假手术组小鼠仅施行手术而不插入鱼线。

1.2.3 组织病理学观察

缺血2h再灌22h后，将小鼠深度麻醉，迅速打开胸腔，暴露心脏，用镊子捏住心脏，将针头从心尖部位插入，向上进针到升主动脉，用剪刀在右心房处剪一小口，灌注4g/100mL多聚甲醛，直至回流液变清后，断头取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，然后冠状切4刀，共5片。第一刀在脑前极与视交叉连线中点处，第二刀在视交叉部位，第三刀在漏斗柄部位，第四刀在漏斗柄与叶尾极之间，取视交叉部位与漏斗柄部位之间脑组织。用4g/100mL多聚甲醛固定24h，常规石蜡包埋，作连续切片，切片厚度为5μm，进行常规HE染色，观察病理形态学改变。

1.2.4 脑组织髓过氧化物酶(MPO)活性测定

将小鼠断头取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，然后冠状切4刀，共5片。第一刀在脑前极与视交叉连线中点处，第二刀在视交叉部位，第三刀在漏斗柄部位，第四刀在漏斗柄与叶尾极之间，取视交叉部位与漏斗柄部位之间脑组织，利用试剂盒提供的匀浆介质，将脑组织制成10%的组织匀浆，按照MPO试剂盒说明书进行操作。考马斯亮兰法测定蛋白质含量。

1.2.5 细胞间黏附因子-1(ICAM-1)表达检测

石蜡切片经常规脱蜡，水化后，滴加ICAM-1一抗，按试剂盒说明书常规SABC法对标本进行染色，DAB显色，蒸馏水冲洗、脱水、透明、封片。用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。每张切片在缺血区随机采集高倍(×400)视野，观察ICAM-1阳性表达细胞。

1.2.6 统计学处理

采用SPSS13.0 For Windows统计软件进行分析。实验数据均以表示，多组间数据比较采用单因素方差分析，两组间数据比较采用t检验。P＜0.05表明差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 组织病理学变化

图1 脑缺血再灌注小鼠脑组织病理学观察(×400)Fig.1 Histopathological observation on mouse brain tissue with cerebral ischemia/reperfusion inflammatory injury (×400)

由图1可知，假手术组脑组织神经细胞形态正常，核膜清楚，未见神经细胞变性坏死及间质水肿等明显病理变化。模型组神经细胞及血管周围间隙增大，间质水肿明显，形成软化灶，神经元结构模糊，出现不同程度的核深染、核固缩、核溶解、核体不规则。甘草苷处理组与模型组相比，组织病理学变化较轻，仅有轻微水肿，软化灶减小，核固缩、核深染程度有不同程度减轻。结果表明甘草苷能减轻脑缺血再灌注小鼠脑组织损伤。

2.2 脑组织髓过氧化物酶(MPO)活性

由表1可见，小鼠在脑缺血2h再灌注22h后，脑组织MPO活性明显升高，模型组与假手术组相比差异显著。与模型组比较，甘草苷高、中、低剂量组MPO活性显著下降，并呈剂量依赖性，提示甘草苷可抑制中性粒细胞的浸润。

表1 甘草苷对小鼠脑缺血再灌注后MPO活性的影响(n=8)Table 1 Effect of liquiritin on MPO activity in mice after cerebral ischemia/reperfusion (n=8)

2.3 细胞间黏附因子-1(ICAM-1)表达

图2 甘草苷对小鼠脑缺血再灌注后ICAM-1表达的影响(×400)Fig.2 Effect of liquiritin on ICAM-1 expression in mice after cerebral ischemia/reperfusion (×400)

细胞间黏附因子-1(ICAM-1)阳性表达为胞浆呈棕黄色。由图2可知，假手术组少见细胞阳性表达且呈弱阳性表达，模型组阳性表达细胞数量较多，表达强度也较强。与模型组相比，甘草苷各剂量组阳性表达细胞数量减少，表达强度减弱。因此，甘草苷可有效抑制ICAM-1的表达。

3 讨 论

目前，早期溶栓是治疗脑缺血最有效的措施之一，但溶栓后再灌注所引起的并发症限制着溶栓治疗的推广。研究表明，炎症反应在脑缺血再灌注损伤中起着关键作用，包括白细胞的激活浸润和炎性细胞因子的表达等，因此阻断炎症反应是减轻脑缺血再灌注损伤的理想方法[13-15]。

中性粒细胞嗜天青颗粒或单核细胞中的髓过氧化物酶(MPO)可作为中性粒细胞的标记物，利用其还原过氧化氢能力分析其活力，可反映中性粒细胞在组织中浸润程度和分布，以定量反映炎性损伤程度。相关文献报道脑缺血再灌注6h后，出现白细胞浸润，浸润高峰出现在24～36h，6d后恢复正常[16-17]。本实验结果表明缺血2h再灌注22h后，模型组MPO活性显著升高，进一步证实脑缺血再灌注后存在炎症反应。灌胃给予甘草苷治疗，可明显降低缺血再灌注后脑组织MPO活性，减轻中性粒细胞浸润，抑制炎症反应。

细胞间黏附因子-1(ICAM-1)是参与脑缺血炎症反应的重要因子，存在于脑血管内皮细胞、神经细胞或胶质细胞，在缺血再灌注时表达增多。ICAM-1与白细胞受体作用接到白细胞的黏附及迁移，促进白细胞缺血区浸润。白细胞又能增加ICAM-1表达，两者相互作用，从而加重缺血再灌注后脑组织炎性损伤，形成恶性循环[18-19]。在本实验中，与假手术组比较，模型组ICAM-1阳性表达细胞数量增加，表达强度增强，再次验证了脑缺血再灌注可促进炎症反应。结果显示，甘草苷能有效地抑制脑组织中ICAM-1的表达，减轻脑缺血再灌注所引起的炎性损伤。

总而言之，甘草苷可通过降低MPO活性及ICAM-1表达减轻脑缺血再灌注后炎症反应，从而发挥其抗脑缺血再灌注损伤作用。

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Protective Effect of Liquiritin against Cerebral Ischemia/Reperfusion Inflammatory Injury in Mice

SUN Ya-xuan1,2，LIU Ting3，DAI Xue-ling1，GAO Zhao-lan1，WEI Rong1，ZHENG Qiu-sheng3
(1. College of Appllied Sciences and Humanities, Beijing Union University, Beijing 100191, China；2. Cold and Arid Regions Environmental and Engineering Research Institute, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China；3. Department of Pharmacy, Shihezi University, Shihezi 832003, China)

Objective: To investigate the protective effect and mechanism of liquiritin against cerebral ischemia/reperfusion inflammatory injury in mice. Methods: ICR mice were randomly divided into sham group, model group, positive control group (intraperitoneally administered edaravone, 3 mg/(kg bw·d)), and liquiritin groups (intragastrically administered, 40, 20 mg/(kg bw·d) and 10 mg/(kg bw·d)). Focal cerebral ischemia/reperfusion models were set up by using intraluminal filament method. After cerebral ischemia for 2 h and subsequent reperfusion for 22 h, histopathology changes were monitored, and the activity of MPO and the expression of intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1) in brain tissue were measured. Results: Compared with the model group, liquiritin noticeably decreased the activity of MPO and the expression of ICAM-1. Conclusion: Liquiritin has protective effects against cerebral ischemic/reperfusion inflammatory injury.

liquiritin；cerebral ischemia/reperfusion；inflammatory injury；MPO；intercellular adhesion molecule-1

R931.71

A

1002-6630(2010)23-0353-03

2010-03-22

北京联合大学校级课题资助项目(zk200905x)

孙雅煊(1970—)，女，副教授，博士，研究方向为神经生物学。E-mail：sunxx@ygi.edu.cn