儿茶素对马铃薯酪氨酸酶的抑制作用

曾 亮，吴靓靓，官兴丽，罗理勇，刘永胜

(1. 西南大学食品科学学院，重庆 400715；2. 长沙华诚生物科技有限公司，湖南 长沙 410205)

儿茶素对马铃薯酪氨酸酶的抑制作用

曾 亮1，吴靓靓1，官兴丽1，罗理勇1，刘永胜2

(1. 西南大学食品科学学院，重庆 400715；2. 长沙华诚生物科技有限公司，湖南 长沙 410205)

采用分光光度计法测定酶液加入量、底物浓度、温度、pH值对酶活力的影响，确定最适反应条件。在30℃、pH6.8的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲体系中，采用酶动力学方法研究儿茶素对马铃薯酪氨酸酶的抑制效应。结果表明：反应最适条件为酶液加入量0.5mL、底物浓度2mmol/L、温度30℃、pH6.8。儿茶素对马铃薯酪氨酸酶有抑制作用，抑制率达到50% 的儿茶素质量浓度(IC50)约为0.27mg/mL；Lineweaver-Burk图显示儿茶素对马铃薯酪氨酸酶的抑制作用表现为竞争型抑制，抑制常数(KI)为0.16mg/mL。

酪氨酸酶；儿茶素；抑制作用；动力学

酪氨酸酶(EC，1.14.18.1)又称多酚氧化酶，是一种铜蛋白，其活性中心的双核铜离子在酶催化中起重要作用，是黑色素生成的关键酶[1-5]。由于黑色素合成与酪氨酸酶有很大关系，目前，对酪氨酸酶抑制剂的研究非常多，如氢醌、熊果苷、V C、V C衍生物、曲酸等，但是随着化妆品行业的发展，如氢醌等具有很大细胞毒性的物质已很少采用，而VC 不稳定易氧化，曲酸对皮肤有刺激作用，但来自植物等提取物的天然成分则很少有负面影响[6]。

茶多酚作为茶叶中黄烷醇类、黄酮、黄酮醇类、花青素类、茶白素类和酚酸及缩酚酸类组成的混合物，主要成分是黄烷醇衍生物，俗称儿茶素，能清除人体自由基，抑制过氧化，起到祛斑、防晒及抗皮肤色素沉着的作用[7-8]。研究发现[9]，10种传统的韩国茶提取物能抑制蘑菇酪氨酸酶的活性，绿茶提取物是一种强烈的抑制剂，主要活性物质是ECG、GCG、EGCG；且所有儿茶素的没食子酸基是活性位点，GCG表现为竞争性抑制。不同茶叶醇提物抑制酪氨酸酶活性，青茶抑制率达到62.28%[10]。本研究以儿茶素为效应物，研究其对马铃薯酪氨酸酶活性的影响及抑制作用机理，得到有关动力学参数，为儿茶素能在化妆品和医药上得到更好的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

马铃薯 市售。

98%儿茶素 长沙华诚生物科技有限公司；L-多巴(D9628) Sigma 公司；初酪氨酸酶 自提；Na2HPO4·12H2O、

NaH2PO4·2H2O均为分析纯。

722可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酪氨酸酶提取液的制备[11-12]

称取去皮切碎马铃薯2g(-20℃冷冻过夜)，按1:5 (m/V)的比例加入磷酸盐缓冲液(pH6.8)10mL，用力研磨挤压1min，立即3000r/min离心5min，倾出上清液保存于4℃冰箱，在2h内用完。

1.2.2 酶活力测定方法[13-16]

酪氨酸酶活力的测定是基于L-酪氨酸和L-多巴的酶催化氧化产物——多巴色素(dopachrome)在475nm 波长处有最大吸收，其吸光系数为ε=3700mol/(L·cm)。酪氨酸酶反应活性(A C T)定义：以每分钟多巴色素在475nm 波长的吸光度(OD475nm)增加0.001 为一个酶活力单位，即1μmol/min。因此，通过测定酶催化反应体系的OD475nm随时间的增长直线，从直线斜率即可求得酶活力。

在10mL 试管中加入1mL L-多巴(6mmol/L)及1.5mL 磷酸盐缓冲液(pH6.8)中，充分混匀，于30℃水浴中温育10min后，加入0.5mL 酶提液，立即充分混匀，测定OD475nm。

1.2.2.1 酶活力测定的最适条件的选择[12]

时间对酪氨酸酶稳定性的影响：依照以上测定方法，分别在提取出马铃薯酪氨酸酶0、0.5、1、2.0、2.5h时测定酶活力。

最适酶液加入量的选择：依照以上测定方法，分别取马铃薯酪氨酸酶提取液0.1、0.3、0.5、1.0、1.2mL测定酶活力。

最适底物浓度的选择：依照以上测定方法，分别在试管中加入0.5、0.7、0.9、1.0、1.1、1.2mL L-多巴，使底物浓度分别为1.0、1.4、1.8、2.0、2.2、2.4mmol/L，测定酶活力。

最适温度的选择：依照以上测定方法，分别将L-多巴溶液和磷酸盐缓冲液混合后，于25、30、40、60、70℃水浴中温育，测定酶活力。

最适pH值的选择：依照以上方法，分别在试管中加入pH值为5.8、6.5、6.8、7.0、7.5、8.0的磷酸盐缓冲液，测定酶活力。

1.2.2.2 儿茶素对马铃薯酪氨酸酶活力影响的测定及抑制率的计算

在若干10mL试管中按表1加入L-多巴(6mmol/L)及磷酸盐缓冲液(pH6.8)，充分混匀，于30℃水浴中温育10min后，加入0.5mL不同质量浓度(0、0.12、0.24、0.36、0.5、1、2、4mg/mL)的儿茶素溶液，然后加入0.5mL酶提液，立即充分混匀，测定OD475nm[8]。具体操作如下：

表1 儿茶素对马铃薯酪氨酸酶活力影响实验的样品加入顺序Table 1 Different reaction system composition for determining optimal reaction conditions of potato tyrosinase

按以下公式计算儿茶素对马铃薯酪氨酸酶的抑制率：

式中：OD1、OD2、OD3、OD4、分别表示处理组1、2、3、4生物O D475nm值。

2 结果与分析

2.1 反应最适条件的优化

2.1.1 酶稳定性

图1 时间对酪氨酸酶稳定性的影响Fig.1 Effect of duration of storage at 4 ℃ on potato tyrosinase activity

由图1可见，马铃薯酪氨酸酶液在2.0h内酶活力变化不大，说明在此时间内使用酶液，酶活力变化对实验结果造成的影响较小。

2.1.2 最适酶液加入量

图2 酶液加入量对酶活力的影响Fig2 Effect of quantity of enzyme solution on potato tyrosinase activity

当酶液加入过多，造成酶液过量，底物不够，酶

活力增长缓慢甚至下降；酶液过少，酶活力变化较小，趋势不明显。由图2可见，加入1mL酶液，已近饱和，故选择0.5mL为最适加入量。

2.1.3 最适底物浓度

图3 底物浓度对酶活力的影响Fig.3 Effect of substrate concentration on potato tyrosinase activity

由图3可见，当底物浓度在1～2mmol/L时，酶活力随底物浓度的增大而增加，达到2mmol/L后，随着底物浓度的增加，酶活力增加较为缓慢，故选择2mmol/L为最适底物浓度。

2.1.4 最适温度

图4 温度对酶活力的影响Fig.4 Effect of reaction temperature on potato tyrosinase activity

温度是酶催化反应的重要条件。对酶具有双重作用，温度能加速酶反应速率，但温度过高，会加速酶蛋白变性。由图4 可见，30℃时酪氨酸酶的活性最高。

2.1.5 最适pH值

图5 pH值对酶活力的影响Fig.5 Effect of reaction pH on potato tyrosinase activity

pH值也是酶催化反应的重要条件。由图5可知，当pH值 在5.8～6.8之间时，酶活力随pH 值的增大而增加，小于6.8，酶活力相对降低，故选择pH6.8为最适条件。

2.2 儿茶素对马铃薯酪氨酸酶活力的影响

图6 儿茶素质量浓度对马铃薯酪氨酸酶活力的影响Fig.6 Effect of concentration of added catechins on potato tyrosinase activity

图6为儿茶素对马铃薯酪氨酸酶活力的抑制作用曲线，结果表明儿茶素对马铃薯酪氨酸酶具有抑制作用。酪氨酸酶加入量一定，当儿茶素质量浓度小于0.5mg/mL，抑制率随着儿茶素浓度的增大而增大；当儿茶素质量浓度大于0.5mg/mL，抑制率增大趋于平缓，这由于儿茶素浓度达到一定值后，儿茶素过量，酪氨酸酶量饱和，活性降低不明显。抑制率达到50%的儿茶素质量浓度(IC50)约为0.27mg/mL。

2.3 儿茶素对马铃薯酪氨酸酶的抑制动力学分析

图7 儿茶素对马铃薯酪氨酸酶抑制作用的Lineweaver-Burk曲线Fig.7 Lineweaver-Burk plots for the inhibition of catechins on potato tyrosinase activity

图8 斜率与儿茶素质量浓度关系图Fig.8 Relationship between slope and catechins concentration

在测酶活体系中，固定加入酶量，改变底物L-多巴的浓度，测定酶在不同浓度抑制剂下的催化活力。以酶反应的初速度的倒数对底物浓度Cs作图为一组双曲线，说明酶促反应遵循米氏(Michaelis-Menten)动力学方程。以Lineweaver-Burk 双倒数作图，可以判断儿茶素对该酶的抑制作用类型。结果如图7所示，以Lineweaver-Burk 双倒数作图为相交于一点在纵坐标的一组直线，直线横轴截距随儿茶素质量浓度的改变而改变，而纵轴截距保持不变，表现为竞争型抑制。二次作图，以斜率对儿茶素质量浓度作回归直线，见图8，可以求出儿茶素对马铃薯酪氨酸酶的抑制常数(KI)为0.16mg/mL。

3 讨 论

探究酶液加入量、底物浓度、温度、pH值 4个因素对马铃薯酪氨酸酶活力的影响，发现均有一定程度的影响，当酶液加入量0.5mL、底物浓度2mmol/L、温度30℃、pH6.8时，反应达到最佳水平。其中酶液加入量是针对本实验参照其他方法并有所改进的酶液制备方法而得到的，在不同的制备方法下，得到最适条件会存在不同。由于实验中不同的马铃薯中所含酪氨酸酶活性有所不同，同一马铃薯不同部位的酪氨酸酶活性也有所差异，实验中应采用新鲜、大小相似、同一部位马铃薯提取出的酪氨酸酶液，并在短时间内使用完，以降低实验误差。

儿茶素对马铃薯酪氨酸酶有抑制作用，IC50为0.27mg/mL；Lineweaver-Burk 图显示儿茶素对马铃薯酪氨酸酶的抑制作用为竞争型抑制，其抑制常数(KI)为0.16mg/mL。也就是说，儿茶素能抑制酪氨酸酶的活性中心，与底物L-多巴竞争，导致酶活力下降。除此之外，由于儿茶素结构中存在多个酚羟基，具有很强的清除自由基能力，而反应需在有氧的环境中进行，在一定程度上会抑制酪氨酸酶的表达。

儿茶素作为一种天然的茶叶提取物，要充分发挥其在化妆品及医药业上的用途，仍需加强进一步研究，如其对体外培养动物细胞及在活体中对动物皮肤的影响，乃至对人酪氨酸酶的影响，在基因水平上的影响等等。而且儿茶素有4个单体，不同的单体对酪氨酸酶抑制效果可能存在不同，加之本身性质活泼，容易被氧化，针对儿茶素的特点来开发利用对其今后的发展想必会有帮助。总之，儿茶素是一种具有市场潜力的酪氨酸酶抑制剂。

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Inhibitory Effect of Catechins on Potato Tyrosinase

ZENG Liang1，WU Liang-liang1，GUAN Xing-li1，LUO Li-yong1，LIU Yong-sheng2
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China；2. Changsha Huacheng Biotechnology Co. Ltd., Changsha 410205, China)

The effects of the quantity of enzyme solution, substrate concentration, temperature and pH on the activity of potato tyrosinase were determined by spectrophotometer method in order to determine the optimal reaction conditions of potato tyrosinase. Along with this, the inhibitory effect of catechins on potato tyrosinase in a Na2HPO4-NaH2PO4 buffer solution (pH 6.8) at 30 ℃ was examined by enzymatic kinetics methods. The optimal conditions for the reaction of potato tyrosinase were found to be adding 0.5 mL of the crude tyrosinase solution extracted from potato to the 2 mmol/L substrate solution for reaction at 30 ℃, pH 6.8. Catechins could inhibit potato tyrosinase, and the concentration for 50% inhibition rate was approximately 0.27 mg/mL. The Lineweaver-Burk plot showed that the inhibitory effect of catechins on potato tyrosinase was competitive, and the inhibition constant (KI) was 0.16 mg/mL.

tyrosinase；catechins；inhibitory effect；kinetics

O625.31

A

1002-6630(2010)23-0310-04

2010-09-20

西南大学基本科研业务费专项(XDJK2010C076)；教育部博士点基金项目(20100182120014)

曾亮(1980—)，女，副教授，博士，主要从事茶及天然产物研究与开发。E-mail：zengliangbaby@126.com