柏树火焰层孔菌菌丝体发酵工艺条件优化

苏 珏，贺新生*，竹文坤

(西南科技大学生命科学与工程学院，四川 绵阳 621010)

柏树火焰层孔菌菌丝体发酵工艺条件优化

苏 珏，贺新生*，竹文坤

(西南科技大学生命科学与工程学院，四川 绵阳 621010)

柏树火焰层孔菌是中国以及亚洲菌物的新记录属中的新记录种，是一种稀有的药用菌。为寻求高产的生长条件和经济的培养基，进行转速、温度、pH值、培养液装瓶体积、接种量、碳源、氮源、C/N对菌丝体生长影响的单因素试验和多因素试验设计，利用液体培养基探索这些条件对菌丝体产量的影响。结果表明：菌丝生长最适碳源为淀粉，最适氮源为麸皮，P、K、Mg对菌丝的生长具有促进作用，最适C/N为20:1～25:1；菌丝生长的最适转速为150r/min，温度为25～30℃，最佳pH值为5～7，最适培养液装瓶体积为100mL，最适接种量为8mL/100mL。液体培养基的最佳营养条件为：葡萄糖 25g/L、麸皮 125g/L、 K2HPO40.25g/L、pH 6.5。通过生长曲线实验得到Logsitic方程为：y= 0.22/(1+ 1.019e-0.013x)。

柏树火焰层孔菌；液体发酵；菌丝体产量

柏树火焰层孔菌(Pyrofomes demidoffii (L é v.) Kotl.& P o u z a r)分类学地位属菌物界(F u n g i)，担子菌门(Basidiomycota)，伞菌纲(Agaricomycetes)，多孔菌目(Polyporales)，多孔菌科(Polyporaceae)，火焰层孔菌属(Pyrofomes Kotl. & Pouzar)[1]。全球记载该属有7种。柏树火焰层孔菌主要分布于中欧、非洲和北美，该菌特异性着生于刺柏属(Juniperus L.)树木，会造成树木的白色心材腐朽病[2-4]。

Dai等[5]于2006年在四川卧龙大熊猫自然保护区采集到该菌的子实体，分离得到了纯菌种，鉴定为柏树火焰层孔菌，是中国和亚洲的新记录属中的新记录种。该菌菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO:1932。柏树火焰层孔菌是一种稀有的药用真菌，当地群众把该菌的子实体当成抗癌药物长期使用。为探索该菌的生物学特性，本实验采用液体培养方法对柏树火焰层孔菌的菌丝体生长特性进行研究[6]。

1 材料与方法

1.1 供试菌种

柏树火焰层孔菌野生子实体采集于卧龙大熊猫自然保护区2棵有5 00年以上树龄的刺柏 (J un ip e ru s formosana Hayata) 树干上，共生长了10多个子实体，采集日期为2006年8月23日，组织分离得到纯菌种。

1.2 培养基

斜面培养基：PDA培养基； 种子培养基：PDA培养基去掉琼脂、MgSO4·7H2O 0.5g、K2HPO41.0g、KH2PO40.46g；液体发酵基础培养基：葡萄糖20g、蛋白胨2g、MgSO4·7H2O 0.5g、K2HPO40.1g、KH2PO40.46g。

1.3 方法

1.3.1 种子液制备

将保存的菌种接到斜面培养基上，于25℃下培养8d。取活化菌种1cm2左右接入装有150mL种子液培养基的250mL输液瓶中，于25℃、150r/min条件下培养10d。

1.3.2 单因素试验

1.3.2.1 碳源对菌丝体生长的影响

以2g/L蛋白胨为氮源，分别用葡萄糖、蔗糖、果糖、淀粉、乳糖、木糖、甘露醇、山梨醇、纤维素钠、木质素作碳源，用量均为20g/L，重复3次。250mL输液瓶装100mL液体培养基，等量接种，置旋转式摇床150r/min，25℃振荡培养10d。以下单因素试验培养条件与此相同。

1.3.2.2 氮源对菌丝体生长情况的影响

以20g/L的葡萄糖为碳源，每1000mL培养基分别用蛋白胨2g、酵母浸膏5g、硝酸钾3.7g、硝酸铵1.7g、氯化铵1.5g、硫酸铵2g、尿素1g、干酪素2g、麸皮50g、玉米粉75g、米糠75g作氮源，重复3次取平均值。

1.3.2.3 无机盐对菌丝体生长情况的影响

以2g/L的蛋白胨为氮源，20g/L的葡萄糖为碳源，分别设硫酸镁、硫酸铁、硫酸锌、硫酸钙、硫酸钾、磷酸二氢钠6个处理，用量均为0.5g/L，重复3次取平均值。

1.3.2.4 C/N比对菌丝体生长情况的影响

以20g/L葡萄糖为碳源，固定用量。蛋白胨为氮源，使培养液的C/N为35:1～5:1，级差为5，共7个处理，重复3次取平均值。

1.3.2.5 转速对菌丝体生长情况的影响

以最适碳源和氮源分别代替发酵基础培养基中的葡萄糖和蛋白胨配制培养基(下同)。接种后分别放入90、110、130、150、170、190r/min的摇床上进行培养，温度为25℃，重复3次取平均值。

1.3.2.6 温度对菌丝体生长情况的影响

250mL输液瓶装100mL配制的培养液。接种后分别放入15、20、25、30、35℃的恒温摇床中培养，重复3次取平均值。

1.3.2.7 pH值对菌丝体生长情况的影响

将配制好的培养液调节pH值分别为1、2、3、4、5、6、7、8、9、1 0，然后分别进行分装，装液量为100mL，接种，150r/min摇床培养，重复3次取平均值。

1.3.2.8 培养液装瓶体积对菌丝体生长情况的影响

将配制好的培养液分装成60、80、100、120、140、160mL于250mL的输液瓶中，重复3次取平均值。

1.3.2.9 接种量对菌丝体生长情况的影响

在输液瓶中分装100mL配制好的培养液。接种量设为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mL/瓶10个梯度，重复3次取平均值。

1.3.3 多因素试验

采用均匀试验设计方法，选择筛选出的碳源、氮源、K2HPO4、pH值4个因素，试验因素水平设计如表1 0，共9个处理，重复3次取平均值。

1.3.4 生长曲线实验

用基础培养基，装液量为100mL，灭菌等量接种，150r/min、25℃振荡培养，每24h测菌体干质量，重复3次取平均值。

1.3.5 指标测定

菌丝球个数：用计数器记录所有菌球个数。

菌丝球直径：取发酵液用水稀释10倍，随机取20个菌球在培养皿中排成一行，用游标卡尺测定总长度，重复3次，求其平均值。

菌丝体干质量：收取的发酵液用双层纱布过滤得菌丝球，用蒸馏水冲洗3次后于60℃下烘干至质量恒定。

2 结果与分析

2.1 碳源对菌丝体生长的影响

由表1可知，对菌丝体产量方差分析(DPS 6.01软件，下同)得到，F=12.6440，P＜0.01，差异极显著，表明菌株在不同碳源条件下培养，菌丝体产量有显著变化。菌丝体在淀粉中长势最好，其次分别是葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露醇、木糖、木质素、山梨醇、乳糖，最差的是纤维素钠。

2.2 氮源对菌丝体生长的影响

由表2可知，对菌丝体产量进行方差分析得到

F=20.75，P＜0.01，差异极显著，表明菌株在不同氮源条件下培养，菌丝体产量有显著变化。柏树火焰层孔菌在各种氮源中均能生长，在麸皮中长势最好，其次分别是米糠、尿素、干酪素、蛋白胨、玉米粉、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钾、酵母膏和氯化铵。在天然培养基中的生长普遍比非天然培养基好。菌丝球的直径在麸皮和米糠中最大，菌丝球的个数在干酪素中最多。

2.3 无机盐对菌丝体生长的影响

表1 不同碳源对菌丝体生长的影响Table 1 Effect of carbon sources on mycelial growth

表2 不同氮源对菌丝体生长情况的影响Table 2 Effect of nitrogen sources on mycelial growth

表3 不同无机盐对菌丝体生长的影响Table 3 Effect of mineral elements on mycelial growth

由表3可知，对菌丝体产量进行方差分析得到，F=94.00，P＜0.01，差异极显著，表明菌株在不同无机盐条件下培养，菌丝体产量有显著变化。Fe2+和Zn2+对柏树火焰层孔菌的生长具有抑制作用。P、K、Mg元素对菌丝体生长均有较好的促进作用。

2.4 C/N比对菌丝体生长的影响

表4 不同碳氮比对菌丝体生长的影响Table 4 Effect of C/N ratio on mycelial growth

由表4可知，对菌丝体产量进行方差分析得F=8.5710，P＜0.01，表明不同的碳氮比对菌丝体产量的影响极显著。为提高菌丝体产量，节约成本，C/N应控制在20:1～25:1之间。

2.5 转速对菌丝体生长的影响

表5 不同转速对菌丝体生长的影响Table 5 Effect of rotational speed on mycelial growth

由表5可知，转速为150r/min时，菌丝体的产量最高为0.17g，对菌丝体产量进行方差分析得F=19.27，P＜0.05， 表明在不同转速条件下菌丝体产量差异显著。对菌丝球直径和密度进行方差分析，F直径=12.96，P＜0.01，表明在不同转速条件下菌丝球直径有极显著差异；F密度=31.57，P＜0.01，表明在不同转速条件下菌丝球数量有极显著差异。

2.6 温度对菌丝体生长的影响

表6 不同温度对菌丝体生长的影响Table 6 Effect of temperature on mycelial growth

由表6可知，菌丝体产量在25℃时最大，菌丝球直径在30℃最大，菌丝球密度在25℃最大。对菌丝体产量进行方差分析，F=9.218，P=0.09，表明差异不显著。对菌丝球直径和密度进行方差分析，F直径=5.214，P＜0.05，差异显著，表明在不同转速条件下菌丝球直径有显著差异；F密度=15.457，P＜0.01，差异极显著，

表明在不同转速条件下菌丝球数量有极显著差异。2.7pH值对菌丝体生长的影响

表7 不同pH值对菌丝体生长的影响Table 7 Effects of initial medium pH value on mycelial growth

由表7可知，pH值在5～7时菌丝体产量最大，说明柏树火焰层孔菌的生长条件是适合中性偏酸性。对菌丝体产量进行方差分析得F＝33.026，P＜0.01，差异极显著。对菌丝球直径和密度进行方差分析，F直径= 34.34，P＜0.01，差异极显著，表明在不同pH值条件下菌丝球直径有极显著差异；F密度=98.14，P＜0.01，差异极显著，表明在不同pH值条件下菌丝球数量有极显著差异。

2.8 培养液装瓶体积对菌丝体生长的影响

表8 不同装瓶体积对菌丝体生长的影响Table 8 Effects of bottled volumes on mycelial growth

由表8可知，菌丝体产量在培养液为140mL/瓶中最大，培养液为100mL/瓶时发酵液单位体积菌丝体产量最高，表明最佳装瓶体积应该是100mL。菌丝球直径最大的是160mL/瓶的，菌丝球个数最多的是60mL/瓶的。产生此原因可能是因为瓶中培养液体积小使菌丝球相互碰撞的次数多，使菌丝更加的分散，它的个数也相应的较多。

单瓶产量(y)对装瓶体积(x)的二元回归方程：y=-0.000017x2+0.00454x-0.148，R2=0.975，P＜0.01，二元线性回归极显著。由二元回归方程可知，当装瓶体积为133mL时，单瓶最高产量ymax=0.15g。

单位体积产量y对装瓶体积(x)的二元回归方程：y=-0.000013x2+0.002621x-0.000857，R2=0.968，P＜0.01，二元线性回归极显著。由二元回归方程可知，当装瓶体积为101mL时，单位体积最高产量ymax=0.13g。

对菌丝球直径和个数进行方差分析得：F直径=6.27，P＜0.01，差异极显著，表明在不同装瓶体积条件下菌丝球直径有极显著差异；F密度=78.64，P＜0.01，差异极显著，表明在不同装瓶体积条件下菌丝球数量有极显著差异。

2.9 接种量对菌丝体生长的影响

表9 不同接种量对菌丝体生长的影响Table 9 Effects of inoculum amont on mycelial growth

由表9可知，在接种量为1、2mL时菌丝体产量相同，菌丝球直径大小相差不大；菌丝球个数在接种量为10mL时最大。方差分析表明，F直径=2.56，P＜0.05，差异显著，表明在不同接种量条件下菌丝球直径有显著差异。F密度=277.54，P＜0.01，差异极显著，表明在不同接种量条件下菌丝球数量有极显著差异。

2.10 多因素试验结果

表10 多因素均匀试验设计表Table 10 Factors and levels in multifactor uniform design

如表10所示，多因素试验中菌丝体最低产量为0.05g，最高产量为0.21g，方差分析表明各个处理组的结果差异显著，4个因素对菌丝体产量的影响方程为：y= -4.031-0.321x1-0.069x2-17.532x3+1.205x4。由方程可知，K2HPO4和pH值对结果的影响较大，葡萄糖和麸皮对结果的影响较小。配方6的菌丝体产量最高，表明葡萄糖含量为25g/L、麸皮 125g/L、K2HPO40.25g/L、pH6.5时，柏树火焰层孔菌的菌丝体产量最高。

2.11 生长曲线实验

由图1可知，菌丝体生长动态关系符合Logistic方程，生长曲线方程为：y=0.22/(1+1.019e-0.013x)。柏树火焰层孔菌液体发酵培养大致经历4个阶段。前4d菌丝生长速率缓慢，基本处于代谢调控状态；第4～10天，菌丝生长速率大大增加，处于对数生长期；第11～14天，菌丝的合成代谢和分解代谢基本相等，菌丝体产量处于稳定期；第15天后，菌丝体产量开始减少，进

入衰老期。因此，在第11～14天停止发酵最经济。

图1 柏树火焰层孔菌菌丝体生长曲线Fig.1 Growth curve ofP. demidoffiimycelia

3 结 论

柏树火焰层孔菌菌丝体可以通过液体发酵方式获得，其发酵的最佳条件为：转速150r/min、温度25～30℃、最佳pH值在5～7。在相同条件下，单瓶产量是培养液装瓶体积为140mL时最高，单位体积的产量是培养液装瓶体积为100mL时最高，接种量8mL/100mL最为适宜。淀粉是长势最好的碳源，麸皮是最廉价高产的氮源， P、K、Mg对菌丝体的生长均有较好的促进作用，Fe、Zn对菌丝体生长具有显著抑制作用。液体培养的最佳营养条件为：葡萄糖 25g/L、麸皮 125g/L、K2HPO40.25g/L、pH6.5。柏树火焰层孔菌的生长曲线方程为：y=0.22/(1+1.019e-0.013x) ，发酵终点是11～14d，菌丝体产量为0.22g/100mL。

[1]KIRK P M, CANNON P F, MINTER D W, et al. Ainsworth & Bisby’s dictionary of the fungi[M]. 10th ed. London: CABI Bioscience, CAB International, 2008.

[2]RYVARDEN L, GILBERTSON R L. European polypores part 2. Synopsis fungorum:Volume 7[M]. Norwegian: Fungiflora, 1994: 7; 394-743.

[3]BEGA R V. Diseases of pacific coast conifers technical coordinator[M]. US, Washington: Forest Service US. Dept. of Agriculture, 1978.

[4]ZAKAULLAH. Decay in the Ziarat juniper forests of Baluchistan[J]. Pakistan Journal of Forestry, 1978, 28: 28-34.

[5]DAI Y C , HE X S. Pyrofomes demidoffii newly reported to cause a white trunk rot of juniper (Juniperus formosana) in China[J]. Plant Pathology, 2009, 58(4): 796.

[6]贺新生, 王茂, 李艳秋, 等. 树舌灵芝菌丝体发酵工艺条件试验[J].食品科学, 2008, 29(3): 288-292.

Optimization of Culture Conditions for the Mycelial Growth of Pyrofomes demidoffii

SU Jue，HE Xin-sheng*，ZHU Wen-kun
(School of Life Science and Engineering, Southwest University of Science and Technology, Mianyang 621010, China)

Pyrofomes demidoffii is a newly recorded species of a newly recorded genus in China, and it is also a rare medicinal mushroom. To find a both high yield and economical medium for the mycelial growth of Pyrofomes demidoffii, several culture conditions including carbon source, nitrogen source, C/N ratio, rational speed, culture temperature, initial medium pH value, the volume of medium in the fermentation vessel and inoculum amount were investigated through single factor experiments and the effects of three medium components and pH on the mycelial growth of Pyrofomes demidoffii were analyzed by multifactor uniform design. The above investigations were performed using a liquid medium. The optimum carbon source, nitrogen source and C/N ratio for the mycelial growth of Pyrofomes demidoffii were starch, wheat bran and 20:1-25:1. The mycelial growth of Pyrofomes demidoffii was promoted by P, K and Mg. A pH range between 5 and 7, the volume of medium in the fermentation vessel of 100 mL and inoculum amount of 8 mL/100mL were found optimum. The optimum composition of the liquid medium used consisted of glucose 25 g/L, bran 125 g/L and K2HPO4 0.25 g/L, pH 6.5. The mycelial growth of Pyrofomes demidoffii could be described by the logistic equation: y = 0.22/(1+1.019e-0.013x).

Pyrofomes demidoffii；liquid-state fermentation；mycelial yield

TQ920.6；S567.31

A

1002-6630(2010)23-0146-05

2010-01-20

四川省科技厅平台建设项目(08zh0009)；西南科技大学研究生创新基金项目(09ycjj02)

苏珏(1985—)，女，硕士，主要从事天然药物化学(菌物学)研究。E-mail：sujue6@163.com

*通信作者：贺新生(1965—)，男，教授，本科，主要从事食用、药用蕈菌资源研究。E-mail：hexinsheng@swust.edu.cn