两种羊肚菌胞内多糖体外抗氧化性

杨 芳，王新风,*，翁 良，戈群妹，陈珊珊

(1.淮阴师范学院生命科学学院 资源微生物研究所，江苏 淮安 223300；2.江苏省生态农业生物技术重点实验室，江苏 淮安 223300)

两种羊肚菌胞内多糖体外抗氧化性

杨 芳1,2，王新风1,2,*，翁 良1，戈群妹1，陈珊珊1

(1.淮阴师范学院生命科学学院 资源微生物研究所，江苏 淮安 223300；2.江苏省生态农业生物技术重点实验室，江苏 淮安 223300)

用水提醇沉法提取北京羊肚菌(MB)和淮阴羊肚菌(MH)菌丝体胞内多糖(IPS1)，经脱色及脱蛋白得纯化多糖(IPS2)。采用水杨酸法测定IPS1和IPS2对·OH 的清除作用；邻苯三酚自氧化法测定IPS1和IPS2对O2·的抑制作用。结果表明： IPS1和IPS2均能明显地清除·OH和抑制O2·的能力，在1～5mg/mL质量浓度范围，抗氧化活性随质量浓度的增加而增加。MB和MH提取的IPS1和IPS2清除O2·能力差异不显著，MB和MH提取的IPS1清除·OH能力的差异也不显著，MH提取的IPS1和IPS2之间清除·OH能力差异显著，质量浓度为5mg/mL时，IPS1清除能力只有22.57%，而IPS2清除能力高达46.27%，表明MH的胞内多糖的清除·OH能力明显高于MB胞内多糖。

羊肚菌；胞内多糖；抗氧化性

羊肚菌(Morchella esculenta L.)隶属子囊菌亚门(Ascomycotina)、盘菌纲(Discomycetes)、盘菌目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellaceae)、羊肚菌属(Morchella)，因其菌盖表面呈许多小凹坑，外观极似羊肚而得名。羊肚菌又名羊肚菜，是一种野生名贵食药用真菌，最早收录于李时珍的《本草纲目》[1]。羊肚菌性平、味甘。能益肠胃、化痰理气，是一种良好的中药。近来研究发现羊肚菌富含多糖。真菌多糖具有免疫调节功能和抗肿瘤功能。免疫调节作用是大多数活性多糖的共同特性[2-3]，也是它们发挥其他生理和药理作用(如抗肿瘤)的基础。许多多糖都是哺乳动物的免疫调节剂[4]。真菌多糖并不能直接杀死肿瘤细胞，但却

可以刺激机体免疫能力，从而达到抑制肿瘤细胞增生的目的[5]。因此真菌多糖具有极其重要的利用与开发价值。羊肚菌胞内多糖(IPS)是羊肚菌的重要活性成分，本实验室以羊肚菌胞内多糖为研究对象，对两种不同来源羊肚菌进行胞内多糖(IPS1和IPS2)抗氧化性进行研究，为今后更好的利用与开发羊肚菌多糖抗氧化功能提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

羊肚菌(Morchella esculent L.)母种分别购自中国农业大学食用菌研究室(MB)和采集分离自江苏盱眙的母种(MH)。

1.2 试剂

蒽酮、95%乙醇、水杨酸、过氧化氢、FeSO4· 7H2O、邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷(Tris)，以上试剂均为分析纯 淮安国药化学试剂有限公司。

1.3 仪器与设备

T6新世纪紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；TDL-5000B离心机 上海安亭科学医学仪器厂；BS210S电子天平 北京赛多利斯天平有限公司；HD-930型组合式全温摇床 江苏太仓市实验仪器厂；水浴锅 金坛市正基仪器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 羊肚菌胞内多糖浸提和纯化[6]

精确称取已研磨好的干菌丝，按加水比50:1(V/m)加入蒸馏水，摇匀后，85℃恒温水浴浸提2h后取出，用滤纸过滤，残渣再重新提取一次，合并提取液。提取液分两步制备羊肚菌多糖：直接经醇沉法制得羊肚菌胞内粗多糖(IPS1)；经5% H2O2脱色和Sevag法脱蛋白后，再醇沉、真空干燥得羊肚菌精多糖(IPS2)。

1.4.2 羊肚菌多糖测定

采用蒽酮比色法，参考文献[7]。

1.4.3 羊肚菌中各种提取液对·OH的清除率的测定[8-10]

将IPS1和IPS2配制成一系列梯度浓度的液体，采用水杨酸法测定IPS1和IPS2对·OH清除率。

式中：A0为空白对照液的吸光度；AX为加入待测溶液后的吸光度；AX0为待测溶液的本底吸光度。

1.4.4 羊肚菌中各种提取液对O2·清除率的测定[11-12]采用邻苯三酚自氧化法，取0.05mol/L pH8.2的Tris-HCl缓冲液4.5mL于试管中，置25℃水浴中预热20min，加入0.1mL各供试液，2.5mmol/L邻苯三酚0.4mL，混匀后在25℃水浴中准确反应4min，立即用8mol/L 0.1mL HCl终止反应，并在299nm波长处测定吸光度(以蒸馏水调零)，对照组用0.1mL蒸馏水代替供试液，同时设立试剂空白管。

1.4.5 数据处理

实验设3次平行，数值采用(x±s)表示。

2 结果与分析

2.1 羊肚菌胞内多糖IPS1和IPS2的含量

表1 两种羊肚菌中IPS1和IPS2的含量Table 1 Contents of IPS1 and IPS2 in the mycelia ofMorchella esculentL. from Beijing and Huaiyin

由表1可知，比较两种羊肚菌中胞内多糖IPS1和IPS2的含量， MH大于MB。经脱色与脱蛋白纯化后得到的IPS2与未经纯化的IPS1之间差距不是很大，后者分别是前者的89.73%和84.62%，说明在粗多糖中蛋白的含量并不多。

2.2 MB中胞内多糖对O2·和·OH的清除率

表2 MB中IPS1和IPS2对O2·和·OH的清除率Table 2 Scavenging rates of CIPSMBand PIPSMBon hydroxyl and superoxide anion free radicals

由表2得知，随着MB中胞内多糖质量浓度的增加，抑制O2·和清除·OH的能力也都是逐渐增加。清除自由基能力最强是多糖含量为5mg/mL，此时IPS1和IPS2抑制O2·能力分别是61%和73.083%，清除·OH能力分别是24.46%和22.57%。运用DPS软件，采用定量数据机率分析方法，得IPS1对O2·的EC50质量浓度是0.0963mg/mL，IPS2对O2·的EC50质量浓度是0.0002mg/mL，且二者清除率回归方程的方差分析F值的显著水平P值分别为0.0029和0.0051。IPS1对·OH的EC50质量浓度是123.9529mg/mL，IPS2对·OH的EC50质量浓度是48.3226mg/mL，且二者质量浓度对数与清除率回归方程的方差分析表明，F值的显著水平P＜0.05(分别为0.00292和0.0051)。说明纯化

后的多糖清除自由基的能力要强于粗多糖。

2.3 MH中胞内多糖对O2·和·OH的清除率

表3 MH中IPS1和IPS2对O2·和·OH的清除率Table 3 Scavenging rates of CIPSMHand PIPSMHon hydroxyl and superoxide anion free radicals

由表3可知，随着MH胞内多糖质量浓度的增加，抑制O2·和清除·OH的能力也都是逐渐增加。清除自由基能力最强是多糖质量浓度为5mg/mL，此时IPS1和IPS2抑制O2·能力分别是63.063%和73.167%，清除·OH能力分别是21.05%和46.27%。运用DPS软件，采用定量数据机率分析方法，得IPS1对O2·的EC50质量浓度是0.0440mg/mL，IPS2对O2·的EC50质量浓度是0.0007mg/mL，且二者清除率回归方程的方差分析F值的显著水平P值分别为0.0008和0.0064。IPS1对·OH的EC50质量浓度是346.5629mg/mL，IPS2对·OH的EC50质量浓度是7.9611mg/mL，且二者质量浓度对数与清除率回归方程的方差分析表明，F值的显著水平P＜0.05 (分别为0.0239和0.0088)。说明纯化后的多糖清除自由基的能力要强于粗多糖。

2.4 VC标准品对自由基的清除作用

表4 VC标准品对O2·和·OH的清除率Table 4 Scavenging rates of vitamin C standard on hydroxyl and superoxide anion free radicals

3 讨 论

多糖分子上均具有还原性的半缩醛羟基，可与氧化剂活性氧发生氧化还原反应[13]。羊肚菌胞内多糖(IPS1和IPS2)具有很强的抗氧化能力，在一定质量浓度范围内，对O2·的清除中其清除能力与多糖的纯度和质量浓度呈正相关，多糖的纯度越高，质量浓度越大其抗氧化能力越强。经纯化后的北京羊肚菌多糖溶液在质量浓度达1mg/mL时，其清除能力为70.406%，在质量浓度从1mg/mL增加到5mg/mL过程中其清除能力只增加不到3%，因而认为当多糖溶液的质量浓度达到一定的范围时，羊肚菌多糖对O2·的清除能力增效不明显，它们之间不存在完全的剂量效应。淮阴羊肚菌的粗多糖和纯化后多糖溶液对O2·的清除能力与北京羊肚菌非常相似，两者间的差异不显著(P=0.08391，0.76838)。

·OH被认为是毒性最强的活性氧自由基，它比高锰酸钾和重铬酸钾的氧化性还强；它的反应性极强，寿命极短，对机体的破坏作用最大，是造成生物有机体过氧化损伤的主要因素。它可以引发组织细胞病变，从而导致各种疾病的发生和加速机体的衰老[14-15]。羊肚菌多糖对·OH有明显的清除作用，淮阴羊肚菌和北京羊肚菌的粗多糖和经脱蛋白纯化后的多糖对·OH的清除率在同样质量浓度下，都较O2·的清除能力低，粗多糖在1～5mg/mL质量浓度范围内的清除能力，两种羊肚菌都在13%～24%之间；而经脱蛋白后得到的纯化多糖的清除率淮阴羊肚菌的纯多糖明显高于粗多糖，但北京羊肚菌的纯化后的多糖对·OH的清除能力却不随着纯度的提高而提高，分析其原因可能因为种间的差异导致的多糖结构表征不同的影响或北京羊肚菌粗多糖中存在与多糖有协同清除·OH作用的蛋白。

由两种来源的羊肚菌粗多糖经脱蛋白纯化后得到纯化多糖的得率分别是84.62%(MB)和89.73%(MH)，淮阴羊肚菌的多糖抗氧化能力优于北京羊肚菌，经脱蛋白纯化的多糖抗氧化能力优于粗蛋白。以VC的抗氧化性为参照，无论是淮阴羊肚菌还是北京羊肚菌，其5mg/mL的粗多糖溶液的抗氧化性都低于1mg/mL的VC标准对照组，只有淮阴羊肚菌纯化后的多糖在清除·OH时2mg/mL多糖溶液相当于0.1mg/mL的VC标准对照组。因此淮阴羊肚菌纯化后的多糖抗氧化能力更强、更经济、更具开发价值。

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Antioxidant Activity of Intracellular Polysaccharides (IPS) from Morchella esculenta L.

YANG Fang1,2，WANG Xin-feng1,2,*，WENG Liang1，GE Qun-mei1，CHEN Shan-shan1
(1.Institute of Resource Microorganism, College of Life Sciences, Huaiyin Normal University, Huai an 223300, China；2. Jiangsu Key Laboratory for Eco-Agricultural Biotechology around Hongze Lake, Huai an 223300, China)

The crude intracellular polysaccharides (CIPSMBand CIPSMH) extracted from the mycelia of Morchella esculenta L. from Beijing (MB) and Huaiyin (MH) areas by water extraction and alcohol precipitation were subjected to decolorization and deproteinization to obtain purified CIPSMBand CIPSMH, denoted as PIPSMBand PIPSMH, respectively. The scavenging effects of the four samples on hydroxyl and superoxide anion free radicals were tested by salicylic acid method and pyrogallol autoxidation method, respectively. It was observed that all the four samples were able to obviously scavenge both free radicals, displaying a positive concentration-dependent response in a concentration range between 1 mg/mL and 5 mg/mL. No statistical significance in the ability to scavenge superoxide anion free radicals was found between CIPSMBand PIPSMBand between CIPSMHand PIPSMH. CIPSMBand CIPSMHhad no significant difference in the ability to scavenge hydroxyl free radicals. However, there was a significant difference in the ability to scavenge hydroxyl free radicals observed between CIPSMHand PIPSMH; the scavenging rate of CIPSMHat a concentration of 5 mg/mL was only 22.57%, whereas that of PIPSMHwas as high as 46.27%, indicating that purification greatly enhances the hydroxyl free radical scavenging capacity of intracellular polysaccharides from the mycelia of Morchella esculenta L. from Huaiyin area.

Morchella esculenta L.；intracellular polysaccharide；antioxidant activity

TS201.3

A

1002-6630(2010)23-0076-03

2010-09-13

江苏省教育厅高新产业项目(JHZD04-006)；江苏省大学生实践创新训练项目(JSDXS20090212)；淮阴师范学院教授基金项目(08HSJSK05)

杨芳(1983—)，女，硕士，主要从事真菌生理生化研究。E-mail：yangfang072@126.com

*通信作者：王新风(1964—)，男，教授，学士，主要从事食品微生物研究。E-mail：wangxf@hytc.edu.cn