基于rDNA ITS序列分析的桑黄真菌菌株分子鉴定

2010-03-22谢丽源邓科君彭卫红甘炳成李洪军

食品科学 2010年9期

谢丽源，张勇*，邓科君，彭卫红，甘炳成，李洪军

(1.四川省农业科学研究院土壤肥料研究所，四川成都 610066；2.西南大学食品科学学院，重庆 400716；3.电子科技大学生命科学与技术学院，四川成都 610054)

谢丽源1,2，张勇3,*，邓科君3，彭卫红1，甘炳成1，李洪军2

对6份桑黄真菌菌株的rDNA ITS区段进行克隆测序和序列特征比较分析，并与GenBank中获得的桑黄基源物种相关序列进行同源性比对，进一步将从GenBank检索获得的桑黄基源物种的ITS序列、复合外组ITS序列连同6份桑黄菌ITS序列一起作系统发育分析。结果表明：Sh-03、04、05、06与Phellinus linteus亲缘关系最近，Sh-01与Phellinus baumii亲缘关系最近，Sh-02与Phellinus baumii、Phellinus linteus、Phellinus igniarius的亲缘关系相差甚远，为一错误菌种。本实验的研究结果可以提供一种准确可靠且简单易行的桑黄真菌分子鉴定技术。

桑黄；Phellinus baumii；Phellinus linteus；Phellinus igniarius；rDNA ITS；分子鉴定

桑黄是担子菌亚门(Basidiomy cota)、层菌纲(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、锈革孔菌科(Hymenochaetaceae)、针层孔菌属(Phellinus)的药用真菌[1]，具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌、消炎、增强免疫等药理活性[2-5]，尤其是显著的抗肿瘤活性，近年来成为研究和开发的热点。桑黄来源于菌物的子实体，在真菌传统形态学分类中，菌物本身形态鉴定有一定的困难，而且受主观因素影响较大，使得在研究及应用中，出现“同物异名”、“同名异物”的现象，有些菌种保藏及生产单位并未对其研究材料作准确的鉴定，随意给出种名，甚至没有种名。随着分子生物学技术的发展，位于18S rDNA及28S rDNA间的rDNA内转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)序列分析技术由于进化速率快、稳定性好和测序方便，已广泛的运用到多种真菌种属水平的分类鉴定研究中[6-11]。因此，本实验采用rDNA ITS技术对6份不同来源的桑黄

真菌进行分子鉴定，对更好地认识和利用桑黄真菌具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

6份桑黄真菌收集自我国各桑黄真菌保藏单位，凭证标本保存于四川省农业科学研究院微生物研究中心，具体信息详见表1。此外，检索GenBank中登录的3种桑黄真菌基源物种(P. baumii、P. linteus、P. igniarius) rDNA ITS序列(去除过短、污染及低质量序列)，下载保存，用于序列比较及系统发育分析。

pMD18-T载体、Taq DNA聚合酶大连Takara公司；引物合成及序列测定由上海Invitrogen公司完成；其他常规试剂购于上海生工生物工程服务有限公司。

BioSpec-mini分光光度仪日本Shimadzu公司；I-Cycler热循环仪、凝胶成像系统美国Bio-Rad公司。

表1 桑黄真菌测试菌株Table 1 The strains used for Sanghuang fungi test

1.2 菌丝体培养

从在PDA平板上培养3d的菌落边缘取2mm×2mm的菌丝块，接种于100mL PDA液体培养基接种到100mL将菌种活化后接种于PDA液体培养基中，25℃浅层静置培养10d，收集菌丝，无菌水漂洗两次，灭菌滤纸吸干水分，－8 0℃保存。

1.3 基因组DNA提取

取0.2～0.5g菌丝体用于基因组DNA提取，参考Murray等[12]的报道并稍作修改：1)液氮中充分研磨，转入2mL离心管中，每管加500μL预热DNA提取缓冲液(1g/100mL CTAB、1.4mol/L NaCl、80mmol/L Tris-HCl pH8.0、20mmol/L EDTA pH8.0)，65℃保温30min，期间摇动2～3次；2)加500μL氯仿-异戊醇(24∶1，V/V)，振荡混匀，10000r/min离心10min；3)取上清，加2×体积预冷无水乙醇，－20℃静置60min，10000r/min离心10min；4)沉淀用75%的乙醇洗涤两次，室温风干；5)沉淀溶于200μL TE(pH 7.6)，RNase(DNase-free)至200mg/L，37℃处理60min；6)加200μL酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1，V/V)，振荡混匀，10000r/min离心10min；7)取上清，加200μL氯仿∶异戊醇(24∶1，V/V)，10000r/min离心10min；8)取上清，加1/10体积3mol/L N aAc、2×体积预冷无水乙醇，混匀，－20℃静置60min，10000r/min离心10min；9)75%乙醇洗涤两次，室温风干，溶于50μL灭菌双蒸水。DNA纯度、以0.8%琼脂糖凝胶和BioSpec-mini分光光度仪检测，将基因组DNA稀释至100ng/μL，－20℃保存备用。

1.4 rDNA ITS扩增及检测

参照White等[6]报道的ITS通用引物ITS4、ITS5及GenBank中登录的Phellinus属真菌rDNA ITS序列，设计ITS-PF(5＇-AGTCGTAACAAGGTTTCCGTA-3＇)、ITSPR(5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇)引物对，由Invitrogen公司进行合成。25μL扩增体系包括：1×PCR buffer、1.5mmol/L MgCl2、200μmol/L dNTPs、0.5 μmol/L上下游引物、50ng基因组模板DNA以及0.5U Taq DNA聚合酶。以I-Cycler热循环仪进行扩增，PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸50s、32个循环；72℃延伸7min。反应完成后，产物中加入6×loading buffer 5μL混匀，于1.0%琼脂糖凝胶上电泳分离，EB染色，Bio-Rad凝胶成像系统拍照、记录结果。

1.5 rDNA ITS序列的克隆和测序

目标产物于1%琼脂糖凝胶上分离，以PCR纯化试剂盒进行回收。回收产物连接入pMD18-T载体，转化大肠杆菌感受态细胞。每个样品均随机挑选5个阳性克隆，委托Invitrogen公司进行双向序列测定，序列信息登录GenBank注册。

1.6 序列比较及系统发育分析

以Guglielmo等[13]公布的Phellinus属真菌rDNA ITS序列为参照，对桑黄真菌rDNA ITS序列进行界定，除去5＇端18S rDNA及3＇端28S rDNA序列，保留ITS1-5.8S-ITS2序列。以Clustal W 1.8[14]进行序列两两比对及多序列比对(PAM250评分矩阵、空位罚分设为默认值)，比对结果进行人工修正。用MEGA 4.1[15]进行系统发育分析和进化树构建，以Kimura 2-parameter模型计算遗传距离，所有对位排列结果中的空位或缺失数据作完全删除处理。以P. tuberculosus(AM269806)、P. tremulae(AM269804)、P. spiculosus(AY558648)、Hydnochaete duportii(DQ404386)、Trametes versicolor (AY309018)、Ganoderma lucidum(FJ940919)为复合外组，用NJ法(neighbor-joining method)构建分子进化树，进行1000次自展抽值检验分子进化树可靠性。

2 结果与分析

以桑黄液体静置培养菌丝体为出发材料，采用改进的CTAB法进行基因组DNA提取，所得DNA溶液紫外吸收OD260nm/OD280nm比值在1.8左右，表明无RNA、蛋白质干扰，纯度较高，菌丝体DNA得率为10～20μg/g。琼脂糖电泳结果表明，基因组DNA主带清晰，DNA片段大小在30kb以上，无拖尾、降解现象，样品间均匀一致(图1)。这说明采用该法提取桑黄基因组DNA质量好、产量高，完全能满足后续PCR扩增对样品基因组DNA质量的要求。

图1 桑黄样品基因组DNA提取电泳检测结果Fig.1 Electrophoresis analysis of genomic DNA isolated from Sanghuang

图2 桑黄样品rDNA ITS序列扩增电泳检测结果Fig.2 Electrophoresis analysis of PCR amplified products using Sanghang rDNA ITS sequences

以桑黄菌丝体基因组DNA为模板，ITS-PF/ITS-PR为引物，进行PCR扩增。扩增产物经1.0%琼脂糖电泳分析，检测到特异性扩增片段，其中Sh-02扩增片段相对较短(约630bp)，其余5个测试样品扩增产物长度分布在730～810bp范围内(图2)。

2.2 桑黄rDNA ITS序列分析

对桑黄rDNA I TS扩增目标位点进行回收、克隆、测序，结果表明本实验分析的6个桑黄样品序列精确长度分别为：Sh-01，812bp；Sh-02，637bp；Sh-03～Sh-06，772bp。通过GenBank数据库BLAST比对，Sh-01与P. baumii真菌rDNA ITS序列显示最高的同源性比对结果，Sh-03～Sh-06与P. linteus的rDNA ITS同源性最高，而Sh-02与P. baumii、P. linteus及P. igniarius的rDNA ITS序列同源性均不显著。依据Guglielmo等[13]公布的Phellinus属真菌rDNA ITS序列为参照，对所有候选rDNA ITS序列进行界定，除去5＇端18S rDNA及3＇端28S rDNA，仅对ITS1-5.8S-ITS2区域序列进行进分析。表2结果表明，桑黄真菌rDNA ITS序列长度区别明显，其中ITS1-5.8S-ITS2区域序列总长度分别为708～710bp(P. baumii)、668～671bp(P. linteus)、594～619bp (P. igni arius)；ITS1序列长度分别为308～310bp (P. baumii)、281～283bp(P. linteus)、214～233bp (P. igniarius)；5.8S序列长度完全一致，均为160bp；ITS2序列长度分别为240～241bp(P. ba umii)、227～229bp(P. linteus)、217～226bp(P. igniarius)。进一步对rDNA ITS序列的碱基构成进行分析，发现不同桑黄真菌rDNA ITS序列中ITS1及ITS2区域GC含量明显相异，这与rDNA IT S序列长度变异相一致。本实验检测的6株桑黄真菌中，rDNA ITS区域存在显著差异，明显区分为3类：1)Sh-01与P.baumii在rDNA ITS序列长度及碱基构成方面基本一致；2)Sh-02的rDNA ITS区域构成较为特殊，与P.baumii、P.linteus及P.igniarius及其余5株检测桑黄真菌明显相异；3)Sh-03、04、05、06的rDNA ITS区域构成基本相同，且与P. linteus基本一致。

表 2 P. baumii,P. linteus和P. igniariusrDNA ITS序列长度及G+C含量变异分析Table 2 Variations in length and (G + C) content of rDNA ITS sequences inP. baumii,P. linteusandP. igniarius

2.3 基于rDNA ITS序列的系统发育分析

对桑黄真菌rDNA ITS序列进行遗传距离分析，从表3可看出，6株桑黄真菌存在明显的遗传分化：Sh-01与P. linteus、P. igniarius分别存在0.031、0.184的遗传差异，与P. ba umii亲缘关系最近；Sh-02明显相异于其他桑黄真菌，遗传距离在0.325～0.381间变动；Sh-03、04、05、06间不存在遗传分化，为相同菌种，且与P. linteus亲缘关系最近。

表 3 基于rDNA ITS序列的桑黄真菌遗传距离分析Table 3 Interspecific and intraspecific genetic distances of Sanghuang

图 3 基于桑黄真菌rDNA ITS序列的NJ系统发育树Fig.3 NJ phylogenetic tree based on rDNA ITS region sequences of Sanghuang

以P. tu berculosus(AM269806)、P. tr emulae (AM269804)、P. spiculosus(AY558648)、H. duportii (DQ404386)、T. versicolor(AY309018)、G. luci dum (FJ940919)为复合外组，依据rDNA ITS序列信息，应用NJ法进行系统发育树构建。由图3可知，所有桑黄真菌明显聚为3个类群(Group Ⅰ，bootstrap=99%；G r o u p Ⅱ，b o o t s t r a p=1 0 0%；G r o u p Ⅲ，bootstrap=99%)。其中Group Ⅰ由P. linteus及Sh-03～Sh-06构成，Group Ⅱ由P. baumii及Sh-01构成，而Group Ⅲ则全部由P. igniarius构成(未检测到本实验测定菌株)。同时，Sh-02明显有别于锈革孔菌科的Out GroupⅡ(H. dup ortii)、Out G roupⅢ(P. tuberculosus、P. tremulae、P. spiculosus)菌种，而与Out GroupⅠ的T. versicolor(AY309018)显示了相对较高的遗传相似性并聚为一类(bootstrap=100%)。系统发育树得到的结果与供试菌种rDNA ITS区全序列信息分析的结果表现了较高的一致性，进一步说明了系统发育树的可靠性。

3 讨论

长期以来真菌主要是依据其子实体形态特征进行鉴定，但是依据子实体形态对大型真菌的分类鉴定不仅受子实体生长环境、生长时期等客观因素的影响，而且形态性状的选取和判断受主观因素的影响也较大，因而基于形态性状特征对大型真菌进行分类鉴定有一定的局限性，尤其是难以人工栽培的真菌，获得作为分类依据的形态学特征较为困难。近年来，采用A F L P、RAPD、ITS序列分析等分子手段在真菌及植物的鉴定中得到广泛的应用，但是，RAPD在鉴定中重复性和可靠性都较差，AFLP对技术要求较高，且在一些物种的鉴定中灵敏性不够，ITS r DNA区域进化速率较快，表现出广泛的序列多态性，对高等植物及大型真菌的鉴定有更好的准确性和灵敏性，适用于不同分类水平的物种鉴定及系统发育研究[16-17]已成功应用于Armillaria属真菌[7]、Pneumocystis属真菌[8]、Lactarius属真菌[9]、Puccinia属真菌[10]、Alnus属真菌[11]等多种真菌的分子鉴定中。由于桑黄真菌物种间形态差异较小，同时培养条件下难以获得子实体，鉴定工作较为困难[18-19]。利用rDNA ITS序列分析技术，可以直接提取蕴含于基因组内的遗传信息，检测和比较出传统形态学方法无法区分的相似菌株种间或种内差别，研究不受生长阶段和形态的限制，大大增加了鉴定的准确性和科学性，借助GenBank等生物数据库的大量信息，从分子水平为桑黄的准确分类、鉴定提供科学依据。

对6份桑黄真菌rDNA ITS位点进行PCR扩增，通过电泳检测已经明显区分出1份疑似菌种(Sh-02)，其余5份材料扩增片段分布在730～810bp范围内，且可大致

分为两类(图2)。通过克隆测序及序列比对，小片段样品Sh-03～Sh-06(772bp)与P. linteus显示最高的序列相似性，而大片段样品Sh-01(812bp)与P. baumii显示最高的序列相似性。通过对ITS1-5.8S-ITS2区域序列进行分析发现，不同桑黄真菌rDNA ITS区域在序列长度、碱基构成方面区别明显(表2)，这与前人的研究结果相一致[7,10-11,20]。依据rDNA ITS序列信息构建NJ系统发育树，6份桑黄真菌明显区分，独立成组(图3)。综合桑黄真菌rDNA I TS序列长度变异、碱基构成差异及系统发育分析的结果，可以明确对测试的6份桑黄真菌样品进行种级分类单元的鉴定：1)Sh-01、Sh-03分别与P. baumii、P. linteus发育关系最近，与P. igniarius显著相异，将其分别正名为P. ba umii、P. lin teus；2) Sh-02与P. baumii、P. linteus、P. igniarius明显相异，更是超越了P h e l l i n u s属的界限，而与不同科的T. versicolor(AY309018)显示了较高的遗传相似性，可以明确将其鉴定为错误菌种；3)Sh-04、Sh-05与P. linteus发育关系最近，为同一物种；4)Sh-06与P. linteus发育关系最近，与保藏结构认定相同。本实结果表明，rDNA ITS序列分析能够有效地把桑黄真菌鉴定到种级分类单元，证明了基于rDNA ITS序列的分子鉴定在桑黄真菌基源物种的鉴定中是可行的，可以有效淘汰疑似菌种，确定同名异物以及同物异名菌株，在生产栽培以及产品开发具有重要意义。

[1]张小青, 戴玉成. 中国真菌志[M]. 北京∶ 科学出版社, 2005∶ 117-191.

[2]KANG D G, CAO L H, LEE J K, et al. Endothelium-dependent induction of vasorelaxation by the butanol extract of Phellinus igniarius in isolated rat aorta[J]. The American Journal of Chinese Medicine, 2006, 34(4)∶ 655-665.

[3]CHO E J, HWANG H J, KIM S W, et al. Hypoglycemic effects of exopolysaccharides produced by mycelial cultures of two different mushrooms Tremella fuciformis and Phellinus baumii in ob/ob mice[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 75(6)∶ 1257-1265.

[4]ZHU Tongbo, KIM S H, CHEN Changyuan. A medicinal mushroom∶Phellinus linteus[J]. Curr Med Chem, 2008, 15(13)∶ 1330-1335.

[5]宋爱荣, 王光远, 赵晨, 等. 火针层孔菌(桑黄)粗多糖对荷瘤小鼠的免疫调节研究[J]. 菌物学报, 2009, 28(2)∶ 295-298.

[6]WHITE T J, BRUNS T, LEE S, et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[M]. New York∶ Academic Press Inc, 1990.

[7]李海波, 吴学谦, 王立武, 等. 青藏高原黄绿蜜环菌纯培养菌种的分离培养及分子鉴定[J]. 菌物学报, 2008, 27(6)∶ 873-883.

[8]LI Zihui, FENG Xianmin, LU Siqi, et al. Molecular phylogeny of Pneumocystis based on 5.8S rRNA gene and the internal transcribed spacers of rRNA gene sequences[J]. Science in China Series C∶ Life Sciences, 2008, 51(5)∶ 445-452.

[9]GEML J, LAURSEN G A, TIMLING I, et al. Molecular phylogenetic biodiversity assessment of arctic and boreal ectomycorrhizal Lactarius Pers. (Russulales; Basidiomycota) in Alaska, based on soil and sporocarp DNA[J]. Molecular Ecology, 2009, 18(10)∶ 2213-2227.

[10]ALAEI H, de BACKER M, NUYTINCK J, et al. Phylogenetic relationships of Puccinia horiana and other rust pathogens of Chrysanthemum× morifolium based on rDNA ITS sequence analysis[J]. Mycological Research, 2009, 113(6/7)∶ 668-683.

[11]TEDERSOO L, SUVI T, JAIRUS T, et al. Revisiting ectomycorrhizal fungi of the genus Alnus∶ differential host specificity, diversity and determinants of the fungal community[J]. The New Phytologist, 2009, 182 (3)∶ 727-735.

[12]MURRAY M G, THOMPSON W F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J]. Nucleic Acids Research, 1980, 8(19)∶ 4321-4325.

[13]GUGLIELMO F, BERGEMANN S E, GONTHIER P, et al. A multiplex PCR-based method for the detection and early identification of wood rotting fungi in standing trees[J]. Journal of Applied Microbiology, 2007, 103(5)∶ 1490-1507.

[14]THOMPSON J D, GIBSON T J, PLEWNIAK F, et al. The CLUSTAL X windows interface∶ flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J]. Nucleic Acids Research, 1997, 25 (24)∶ 4876-4882.

[15]TAMURA K, DUDLEY J, NEI M, et al. MEGA4∶ molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0[J]. Molecular Biology and Evolution, 2007, 24(8)∶ 1596-1599.

[16]王建波, 张文驹, 陈家宽. 核rDNA 的ITS 序列在被子植物系统与进化研究中的应用[J]. 植物分类学报, 1999, 37(4)∶ 407-416.

[17]AGARWAL M, SHRIVASTAVA N, PADH H. Advances in molecular marker techniques and their applications in plant sciences[J]. Plant Cell Reports, 2008, 27(4)∶ 617-631.

[18]戴玉成. 药用担子菌∶ 鲍氏层孔菌(桑黄)的新认识[J]. 中草药, 2003, 34(1)∶ 94-95.

[19]DAI Y C, XU M Q. Studies on the medicinal polypore, Phellinus baumii and its kin, Phellinus linteus[J]. Mycotaxon, 1998, 67(2)∶ 191-200.

[20]LIM Y W, LEE J S, JUNG H S. Type studies on Phellinus baumii and Phellinus linteus[J]. Mycotaxon, 2003, 85∶ 201-202.

Molecular Identification of Medicinal Fungus Sanghuang based on rDNA ITS Sequence Analysis

XIE Li-yuan1,2，ZHANG Yong3,*，DENG Ke-jun3，PENG Wei-hong1，GAN Bing-cheng1，LI Hong-jun2
(1. Soil and Fertilizer Research Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, China；2. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400716, China；3. School of Life Science and Technology, University of Electronic Science and Technology of China, Chengdu 610054, China)

In this study, the ribosomal DNA internal transcribed spacer (rDNA ITS) region of six species of Sanghuang was cloned and sequenced, and the characteristics of ITS sequences were compared and analyzed. The ITS sequences exhibited homology through BLAST analysis of GenBank database and a phylogentic tree was constructed. Results demonstrated that phylogenetic relationship of Sh-03, 04, 05 and 06 was close to Phellinus linteus, and phylogenetic relationship of Sh-01 was close to Phellinus baumii; but Sh-02 had distant phylogenetic relationship with Phellinus baumii, Phellinus linteus and Phellinus igniarius. Therefore, the characteristics of rDNA ITS sequences can be used as an accurate, reliable and straightforward method to identify the original species of Sanghuang and explore genetic diversity.

Sanghuang；Phellinus baumii；Phellinus linteus；Phellinus igniarius；ribosomal DNA internal transcribed spacer；molecular identification

TS201.3

1002-6630(2010)09-0182-05

2009-08-12

四川省青年基金项目(2008ZQ026-072)；四川省科技支撑项目(2008FZ0157)

谢丽源(1977—)，女，助理研究员，硕士，研究方向为食(药)用菌加工。E-mail：xieliyuan77@163.com

*通信作者：张勇(1977—)，男，副教授，博士，研究方向为遗传学。E-mail：zhangyong916@uestc.edu.cn