降胆固醇活性发酵乳杆菌F1发酵酸乳制备条件的研究

杨 瑶，曾小群，潘道东,2,*

(1.南京师范大学 国家乳品加工技术研发分中心，江苏 南京 210097；2.宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江 宁波 315211)

降胆固醇活性发酵乳杆菌F1发酵酸乳制备条件的研究

杨 瑶1，曾小群1，潘道东1,2,*

(1.南京师范大学 国家乳品加工技术研发分中心，江苏 南京 210097；2.宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江 宁波 315211)

以发酵乳杆菌F1发酵制备酸乳，以接种量、发酵时间和发酵温度为考察因素，结合以感官评分为指标的响应面分析方法，确定发酵乳杆菌F1发酵酸乳的最佳发酵条件为：接种量4%、发酵时间8h、发酵温度39℃。利用该条件发酵的酸乳，其胆固醇降解率达到49.16%，比优化前胆固醇的降解率提高了8.79%。

发酵乳杆菌；降胆固醇；响应曲面法

胆固醇是人体内重要的固醇类物质，但围绕胆固醇与人体健康关系在世界范围内食品学界和食品工业界一直存在很大争议[1]。自21世纪30年代有国外学者研究得出“血管壁增厚即动脉粥样硬化症是不正常胆固醇代谢的结果”这一结论以来，已有越来越多的实验和研究表明：胆固醇与动脉粥样硬化、冠心病、脑中风等心脑血管疾病存在密切关系[2]。美国和国内营养和医学专家推荐食物胆固醇的摄入量标准为不超过250～300mg/(d·人)，但随着人民生活水平的提高和膳食营养的增加，胆固醇的摄入量很容易超标。因此，研究不限饮食、不影响食品风味、经济实用的降低食品及人体血清胆固醇水平的方法已成为当前的研究热点[3]。

乳酸菌大量存在于酸乳及其他相关发酵乳制品中。20世纪70年代，科学家先后通过对饮用酸乳等发酵乳制品的非洲Massai人和新生儿血清胆固醇的研究，以及对常饮酸乳美国人健康状况调查，均发现乳酸菌具有降低人体血清胆固醇的作用[4-7]。因此，开发具有降胆固醇作用的乳酸菌及发酵乳制品的研究将具有十分重要的社会意义和应用价值。

通过前期实验研究，本实验室已筛选出一株具有较

高降胆固醇活性的乳酸菌——发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum F1[8]。在此基础上，本实验将对发酵乳杆菌F1发酵制备酸乳过程中的接种量、发酵时间及发酵温度3个因素进行研究，优化发酵乳杆菌F1发酵酸乳的最佳发酵条件，为功能性降胆固醇发酵乳制品的开发应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 菌株

发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum F1为本实验室筛选并保藏菌株[8]。

1.2 培养基

MRS培养基[9]：葡萄糖20g、酵母浸膏5g、牛肉浸膏5g、蛋白胨10g、乙酸钠5g、柠檬酸三铵2.0g、K2HPO4·2H2O 2.0g、吐温-80 1m L、MnSO4·H2O 0.25g、MgSO4·7H2O 0.6g、琼脂15g、H2O 1000mL；高胆固醇培养基(MRS- CHOL)[10]：胆固醇0.1g、牛胆盐0.2g、吐温-80 1mL、冰乙酸5mL配成胆固醇母液，加热溶解后加至1000mL MRS 液体培养基中，超声波细胞粉碎机500W振荡乳化20min，调pH 值至7.0，配成终质量浓度为100μg/mL的MRS- CHOL。以上培养基均在121℃条件下灭菌20min。

1.3 发酵剂配方与试剂

10g/100mL的脱脂奶粉，5g/100mL的绵白糖，95℃杀菌15min。

胆固醇、邻苯二甲醛、冰醋酸、浓硫酸等均为国产分析纯。

1.4 仪器与设备

Spectrum Lab 54 紫外-可见分光光度计 上海棱光技术有限公司；JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；MCFD 5005A 冷冻干燥机 上海安亭科学仪器厂。

1.5 方法

1.5.1 菌种活化

将保藏于－80℃冰箱中的菌种，在MRS平板上划线分离单菌落，单菌落挑取至MRS液体培养基中，37℃培养至浑浊，转接3次进行菌种活化。

1.5.2 发酵剂的制备

将活化的菌种由MRS液体培养基中按体积分数5%的接种量转接到95℃杀菌15min的复原乳中，37℃发酵至凝乳，连续转接两次制成发酵剂。

1.5.3 发酵乳中胆固醇降解率的测定

1.5.3.1 胆固醇含量测定

采用OPA 法(o-phthaladehyde，邻苯二甲醛法)[11]。

1.5.3.2 体外降胆固醇实验

发酵剂5mL接种至100mL含100μg/mL 胆固醇和0.3g/100mL胆盐的高胆固醇培养基(MRS- CHOL)中，37℃静置培养24h，6000r/min 离心5min，上清液冷冻干燥后用于测定胆固醇含量。以未接种的高胆固醇培养基(MRS- CHOL)作对照。

1.5.4 感官评定

将不同样品分别装入纸杯中，选定10名感官评定人员进行感官评价，按照统一标准分别逐项对样品进行打分汇总，以平均分制填评分表。发酵条件优化评价指标为：凝乳状态10分、风味(气味和滋味)10分、组织状态(质构与流变)10分[12]。

1.5.5 响应面分析法优化酸乳发酵条件

根据单因素试验结果，以接种量(x1)、发酵时间(x2)和发酵温度(x3)3个因素与感官评分进行响应面试验设计(表1)，优化发酵乳制备条件。通过Design Expert6.0软件对试验数据进行回归分析，预测发酵乳的最佳发酵条件。

表1 发酵乳制备条件优化试验因素水平及编码Table 1 Factors and levels in central composite design

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 接种量对发酵乳杆菌F1发酵乳品质的影响

添加5%绵白糖的灭菌复原乳接入体积分数为2%、3%、4%、5%的发酵乳杆菌F1，37℃发酵10h后，测定酸度，并进行感官评定，结果见表2。

表2 接种量对发酵乳杆菌F1发酵酸乳品质的影响Table 2 Effect of inoculum amount onL. fermentF1-fermented yogurt quality

表2显示，接种量对酸乳品质影响较大，接种量偏低会导致产酸偏低、凝乳不好、香味淡、偏甜；接

种量偏高时虽然凝乳状态好，但酸度过高导致样品偏酸。综合凝乳状态、风味、组织状态3方面因素, 接种量为4%较为适宜。

2.1.2 发酵时间对发酵乳杆菌F1发酵乳品质的影响

添加5%绵白糖的灭菌牛奶接入体积分数为4%的发酵乳杆菌F1，37℃条件下分别发酵6、8、10、12h后，测定酸度，并进行感官评价，结果见表3。

表3 发酵时间对发酵乳杆菌F1发酵酸乳品质的影响Table 3 Effect of fermentation time onL. fermentF1-fermented yogurt quality

表3显示，发酵时间影响发酵程度。综合凝乳状态、风味、组织状态3方面因素，发酵时间8 h较为适宜。

2.1.3 发酵温度对发酵乳杆菌F1发酵乳品质的影响

添加5%绵白糖的灭菌牛奶接入体积分数为4%的发酵乳杆菌F1，分别于35、37、39、42℃发酵8h后，测定酸度，并进行感官评价，结果见表4。

表4 发酵温度对发酵乳杆菌F1发酵酸乳品质的影响Table 4 Effect of fermentation temperature onL. fermentF1-fermented yogurt quality

如表4所示，发酵温度对酸乳质量影响较大，温度过高或过低都会影响发酵乳杆菌F1的生长，从而影响产品酸度、凝乳状态、风味和组织。综合感官评价，发酵乳杆菌F1在4%接种量发酵8h时，发酵温度为39℃时产品质量较好。

2.2 发酵乳杆菌F1发酵酸乳最佳条件的响应曲面分析接种量、发酵时间、发酵温度3个因素对发酵乳杆菌F1发酵酸乳具有交互影响作用，这种有交互影响的因素单凭单因素试验无法确定他们的影响程度，难以找到最佳组合发酵条件。本实验选择Box-Behnken设计试验，拟通过Design Expert 6.0软件分析来确定最优发酵条件。以接种量、发酵时间、发酵温度为自变量，发酵乳杆菌F1发酵酸乳的感官评分值为响应值，试验设计与结果见表5。利用Design Expert 6.0软件对表5数据进行二次多元回归拟合，得到发酵酸乳感官得分预测值对编码自变量X1、X2和X3的二次多项回归方程：

Y=18.34－0.075X1+0.063X2+0.14X3－1.53X12－0.41X22－1.06X32+0.2X1X2－0.1X1X3+0.025X2X3

表5 发酵乳制备条件优化试验设计与结果表Table 5 Central composite design matrix and predicted and experimental values of sensory score ofL. fermentF1-fermented yogurt

表6 回归模型方差分析表Table 6 Analysis of variance for fitted regression equation

表7 回归方程系数显著性检验表Table 7 Significance test for each regression coefficient of fitted regression equation

对上述回归模型进行方差分析，表6结果表明，模型是极显著的(P＜ 0.0 1)，回归模型的决定系数为0.8989，说明该模型能够解释89.89%的变化，因此，可用此模型对发酵乳制备条件优化效果进行分析和预测。

从表7可知：模型一次项X1、X2、X3均不显著；二次项X12与X32极显著，X22不显著；交互项X1X2、X1X3、X2X3均不显著。

利用Design Expert6.0软件对表5数据进行二次多元回归拟合，所得到的二次回归方程的响应面分析图及其等高线见图1～3。等高线的形状可以反映出因素间交互效应的强弱，圆形表示两因素间交互作用不显著，而椭圆形则显著。

当发酵温度为39℃时，接种量和发酵时间对发酵乳品质的影响见图1。

图1 接种量和发酵时间对发酵乳感官分析得分值影响的响应曲面和等高线Fig.1 Response surface and contour plots showing the interactive effects of inoculum amount and fermentation time on sensory score ofL. fermentF1-fermented yogurt

由图1可知，发酵时间在7～9h范围内，随着发酵时间增加，发酵乳感官得分值先增加，当发酵时间达到一定值后，呈逐渐下降的趋势。当发酵时间恒定，接种量在3.5%～4.5%范围内，发酵乳感官得分值先逐渐增加，达到极大值，随后逐渐下降。

当接种量为4%时，发酵时间和发酵温度对发酵乳品质的影响见图2。

从图2可以看出，发酵温度在38～40℃内，随着发酵温度升高，发酵乳感官得分值不断增加，当发酵温度达到一定值后，发酵乳感官得分值呈下降趋势。发酵时间在7～9h内，随着发酵时间的增加，发酵乳感官得分值也逐渐增加，当发酵时间达到一定值后，继续增加发酵时间反而会影响发酵乳的感官品质。

图2 发酵时间和发酵温度对发酵乳感官分析得分值影响的响应曲面和等高线Fig.2 Response surface and contour plots showing the interactive effects of fermentation time and fermentation temperature on sensory score ofL. fermentF1-fermented yogurt

图3 接种量和发酵温度对发酵乳感官分析得分值影响的响应曲面和等高线Fig.3 Response surface and contour plots showing the interactive effects of inoculum amount and fermentation temperature on sensory score ofL. fermentF1-fermented yogurt

从图3可以看出，发酵温度在38～40℃内，随着发酵温度增加，发酵乳感官得分值先不断增加，当发酵温度达到一定值后，发酵乳感官得分值逐渐减小。接种量在3.5%～4.5%范围内，发酵乳感官得分值先逐渐增加，达到极大值，随后逐渐下降。

为了进一步确证最佳点的取值，对回归方程取一阶偏导等于零并整理得：

方程求解得到：X1=－0.022，X2=－0.091，X3= 0.066；根据表1计算，确定发酵乳杆菌F1的最佳发酵条件为：接种量3.978%，发酵时间7.909h，发酵温度39.066℃。从实际操作考虑，实验确定最终发酵条件为：接种量4%，发酵时间8h，发酵温度39℃。为了进一步验证发酵乳杆菌F1最优的发酵条件，采用上述条件即接种量4%，发酵时间8h，发酵温度39℃进行3次重复实验，结果发酵乳杆菌F1发酵酸乳感官评分值均达到了18.34，优化效果显著。

2.3 发酵乳杆菌F1酸乳最佳发酵条件下胆固醇降解率的测定

采用响应面分析所获得的最佳发酵条件即接种量4%，发酵时间8h，发酵温度39℃，发酵制备发酵乳杆菌F1发酵酸乳。采用1.2.3节方法进行发酵乳中胆固醇降解率的测定，以本研究前期未优化的发酵乳发酵条件(接种量5%，发酵时间10h，发酵温度37℃)为对照，结果发现优化前发酵乳杆菌F1发酵酸乳胆固醇的降解率为40.37%，优化后发酵乳杆菌F1发酵酸乳胆固醇的降解率为49.16%，胆固醇的降解率提高了8.79%。

3 结 论

接种量、发酵时间、发酵温度对酸乳的品质影响很大，通过单因素分析和响应面分析最终确定发酵乳杆菌F1发酵酸乳的最佳发酵条件为：接种量4%、发酵时间8h、发酵温度39℃。体外胆固醇含量测定表明，最佳发酵条件下，发酵乳杆菌F1发酵酸乳胆固醇降解率为49.16%，比优化前提高了8.79%，为降胆固醇功能酸乳开发提供了参考。但是，本实验制备酸乳感官评分不高，原因可能是单菌发酵制备酸乳，菌株产酸能力较弱，在后续实验中可考虑采用混菌发酵工艺。

此外，虽然发酵乳杆菌F1发酵酸乳具有优良的降胆固醇活性，将其开发成功能性乳制品有很好的应用前景，但若要进一步确证其降胆固醇功能性，还需要进行动物模型等体外实验的验证。

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Lactobacillus ferment F1 Fermentation of Yogurt with Cholesterol-degrading Activity

YANG Yao1，ZENG Xiao-qun1，PAN Dao-dong1,2,*
(1. Branch Center of National Dairy Products Processing Technology Development, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China；2. College of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

Cardiovascular disease is now becoming one of the most dangerous diseases. Currently, the development of functional foods to prevent cardiovascular diseases is the hot topic in food science. The probiotic Lactobacillia with cholesterol-degrading activity screened from Chinese traditional fermented foods can be applied to develop functional foods, which will be good for cardiovascular diseases. Lactobacillus ferment F1 was screened to reveal high cholesterol-degrading activity. The effects of inoculum amount, fermentation time and fermentation temperature were investigated to evaluate yogurt quality. The fermentation condition was optimized through response surface analysis (RSA) and the optimal fermentation condition was 4.0% inoculum amount and fermentation at 39 ℃ for 8 h. Under this optimal condition, the degradation rate of cholesterol reached up to 49.16%, and increased by 8.79% than before optimization.

Lactobacillus fermentum F1；cholesterol-degrading activity；response surface method (RSM)

TS201.3

A

1002-6630(2010)09-0126-05

2009-07-10

国家“863”计划项目(2007AA10Z357)；“十一五”国家科技支撑计划项目(2006BAD27B09)；江苏省高校自然科学基金项目(09KJB550003)

杨瑶(1981—)，女，讲师，博士，研究方向为食品微生物学。E-mail：45220@njnu.edu.cn

*通信作者：潘道东(1964—)，男，教授，博士，研究方向为乳品科学。E-mail：daodongpan@163.com