乳酸菌发酵酸豆乳香气成分分析及评价

张 佳，马永昆,,*，崔凤杰，陈 凡，孙乐六，夏 蓉

(1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013；2.江苏省农产品生物加工与分离工程技术研究中心，江苏 镇江 212004)

乳酸菌发酵酸豆乳香气成分分析及评价

张 佳1，马永昆1,2,*，崔凤杰1，陈 凡1，孙乐六2，夏 蓉2

(1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013；2.江苏省农产品生物加工与分离工程技术研究中心，江苏 镇江 212004)

采用顶空固相微萃取(SPME)与气相色谱-质谱(GC-MS)联用检测分析技术，并结合感官评分法对保加利亚乳杆菌、瑞士乳杆菌和嗜热链球菌3种乳酸菌混合发酵的豆乳进行香气分析和评价，探讨不同乳酸杆菌及其与嗜热链球菌按比例混合发酵对酸豆乳香气的影响。感官评定结果表明，乳酸菌种及其混合比例对发酵酸豆乳的香气有明显影响。香气检测分析发现，对比发酵前样品，发酵后酸豆乳中酮类、酸类含量显著增加，而醛类和醇类含量明显减少，3种酸豆乳中相同关键香气成分含量有差异。感官评定与香气检测分析结果一致，1:1的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌组成的菌种产香浓郁，产酸力高，是豆乳发酵的优选菌种。

乳酸菌；酸豆乳；固相微萃取(SPME)；气相色谱-质谱法(GC-MS)；香气

大豆(Glycine max(L.) Merr.)为蝶形花科大豆属一年生草本植物种子，富含蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素、黄酮等成分，具有辅助降血脂、抑制肿瘤和阻止动脉硬化等作用[1]。乳酸菌发酵的酸豆乳可保留大豆的营养功能成分，赋予豆乳特有的乳酸发酵清香、醇香和酯香等，乳酸菌发酵产生的多种蛋白水解酶可使大豆蛋白水解为小分子肽和氨基酸，有利于人体的消化吸收[2]。国内酸豆乳的研究已有十余年时间，但还没有投入工业化生产，主要原因是缺少适合酸豆乳生产的专用菌种，导致其风味存在明显的缺陷[3]。

豆乳乳酸菌发酵可产生乳酸、柠檬酸和乙酸等有机酸，并将柠檬酸代谢过程中产生的α-乙酰乳酸转变成具有发酵豆乳制品特征香气的丁二酮。同时乳酸菌发酵过程中生成的小分子肽和氨基酸，不仅具有一定的生物活性，还会发生进一步脱氨反应，生成酮、醛、醇和酸等成分，形成特有的酸豆乳发酵香[4-5]。本研究从已收集的乳酸菌中筛选出适合豆乳发酵的菌种，利用顶空固相微萃取(SPME)富集、气相色谱-质谱(GC-MS)联用分析检测发酵豆乳的主要香气成分，并结合感官评定，较全面地分析评价了酸豆乳发酵香气成分，为筛选确定适合高质量豆乳发酵的乳酸菌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆 产地山东；纯牛奶 蒙牛乳业股份有限公司。保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) 江苏大学超高压食品技术研究所保藏；瑞士乳杆菌(L a c t o b a c i l l u s helveticus) 丹尼斯克(中国)有限公司；氢氧化钠(分析纯) 上海化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

双极性50μm聚二甲基硅氧烷PDMS萃取纤维头 美国Supelco公司；HP6890/5973气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 酸豆乳制作工艺流程

大豆→去杂→浸泡→热烫→磨浆→胶磨→过滤→加入牛奶得豆乳(豆浆:牛奶体积比为8:2)，然后加入糖(4g/ 100mL 豆乳)→均质→灌装→杀菌→冷却→接种(体积分数4%接种量)→发酵→冷藏后熟→检测

在前期工作的基础上，将筛选的单菌种进行不同方式的组合，并接种发酵。LBS1代表由L.bulgaricus和S.thermophilus按照体积比1:1混合发酵所得的酸豆乳，LHS代表由L. helveticus和S.thermophilus按照1:1混合发酵所得的酸豆乳，LBS2代表由L.bulgaricus和S.thermophilus按照2:1混合发酵所得的酸豆乳。

1.3.2 酸度测定方法

依照GB/T 5409—85《牛乳检测方法》进行。

1.3.3 感官评定标准

选20名经培训合格的食品专业人员作为品评员，评定方法如下：以豆乳(豆浆:牛奶体积比为8:2)为对照，采用嗅闻法对不同的酸豆乳打分，并对结果进行方差分析。评分标准：1) 0～2分：无明显发酵香气；2) 3～5分：有轻微发酵香气；3) 6～8分：有正常发酵香气；4) 9～11分：有浓郁发酵香气(每个样品评3次)。LBS1、LHS和LBS2的发酵酸度分别为73、86.6、64.2°T。

1.3.4 样品处理方法

将首次使用的PDMS固相微萃取头在气相色谱进样口老化至无杂峰，在250℃下老化30min。吸取10mL样品放入15mL样品瓶中，在40℃加热平台上保持10min，将SPME萃取头插入瓶中，磁力搅拌速度100r/min，40℃条件下萃取30min。

1.3.5 GC-MS参数条件

色谱条件：色谱柱：毛细管色谱柱DB-WAX(60m ×0.25mm，0.25μm)；进样口温度250℃，SPME插入进样孔解吸3min；程序升温：始温35℃，保持3min，以3℃/min升至80℃，再以4℃/min升至120℃，再以10℃/min升至230℃，保持8min；载气(He)流速1.0mL/ m i n，不分流。

质谱条件：接口温度280℃，离子源温度230℃，电子能量70eV，质量扫描范围33～450u。

1.3.6 定性定量方法

用HP化学工作站软件对照NIST库进行数据收集，成分先由谱库初步鉴定，再结合化学成分的保留时间、质谱、实际成分和保留指数等进行定性；采用面积归一化法进行相对定量。

2 结果与分析

图1 豆乳香气的总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of aroma components of soymilk

图2 酸豆乳LBS1香气的总离子流图Fig.2 Total ion chromatogram of aroma components of soymilk yogurt LBS1

图3 酸豆乳LHS香气的总离子流图Fig.3 Total ion chromatogram of aroma components of soymilk yogurt LHS

图4 酸豆乳LBS2香气的总离子流图Fig.4 Total ion chromatogram of aroma components of soymilk yogurt LBS2

豆乳和不同乳酸菌发酵酸豆乳总离子图见图1～4。豆乳和不同酸豆乳香气成分，见表1。

表1 豆乳和酸豆乳香气成分的分析结果Table1 Analytical results of volatile components in soymilk and different soymilk yogurts

2.1 酸菌发酵对酸豆乳香气成分的影响

豆乳中共检测出31种，其中主要香气成分是醇、醛类，相对含量分别为45.34%和24.12%。含量相对较高的成分有正己醛(22.63%)、正己醇(18.87%)、1-辛烯-3醇(20.26%)和2-戊基呋喃(2.35%)。这与Wang等[6]、Alaoua等[7-8]检测确定的豆乳主要香气成分基本相同，通常呈现大豆的青腥气，这些异味成分是大豆破碎打浆过程中大豆中的亚麻酸、亚油酸等在脂氧合酶及氧气的共同作用下催化生成的，主要是C6～C9的醛、醇类物质[9-10]。酸豆乳LBS1、LHS和LBS2中分别测出36、3 7和3 4种香气成分，由酮、酸、醇、醛、酯类和呋喃构成，主要香气成分是酮、酸、醇和醛类。其中，酮类相对含量为16.35%～23.28%，酸类为13.76%～22.38%，醇类为18.48%～22.70%，醛类为4.34%～5.56%。

分析结果表明，豆乳发酵前后的香气种类和含量存在明显差异。发酵后的酸豆乳中酮、酸物质的种类和相对含量明显增多，而醇、醛物质含量明显减少，如2,3-丁二酮在豆乳中未检出，而在LBS1、LHS和LBS2中其相对含量分别达到了5.98%、5.04%和4.42%。这是因为α-乙酰乳酸在微生物作用下被分解成3-羟基丁酮后，进一步氧化生成丁二酮[11]；乙酸由发酵前的0.28%分别增加到6.93%、14.98%和8.22%，主要是因为乳酸菌发酵糖产生了乳酸、乙酸和丙酸等，也可能通过氨基酸代谢生成乙酸、丁酸和戊酸等[12]；但正己醛则由发酵前的22.63%分别降低到发酵后的0.25%、0.15%和0.50%，正己醇从18.87%降低到8.82%、9.81%和10.57%。这是由于豆乳经乳酸菌发酵可将羰基化合物转化为酮、醇类和有机酸[13]，表明乳酸菌发酵可明显减轻豆乳的豆腥味，并改善其香气质量。

2.2 不同菌种发酵对酸豆乳香气的影响

表2 酸豆乳中主要挥发性香气的描述及其阈值Table2 Description and odor threshold of volatile compounds in soymilk yogurt LBS1

LBS1共检测到36种香气成分，主要由酮、酸、醛、醇和酯类构成。其中酮类10种，相对含量为23.28%，其次是醇类18.48%、酸类14.38%、醛类5.56%和酯类1.03%，它们呈现清香、甜香、醇香、微弱的酸气和特有的乳酸发酵香。其中占酮类含量18.73%的丁酮类、2-庚酮和3-己酮对LBS1的香气有较大的影响，它们的阈值较低，主要表现出清香、脂香和甜香(表2)，很可能是其发酵产生的特征香气成分[14,16,20]。同时，LBS1中重要香气物质乙醛和丁二酮的含量分别为5.98%和2.06%，均高于LHS和LBS2两种酸豆乳，且乙醛与丁二酮的含量比值为0.345，与Marilley等[21]、王琴等[22]和Wang等[23]报道的乳酸菌种产香质量的评价指标相近。因此，LBS1呈现的清香、甜香、脂香和乳酸发酵香较LHS、LBS2协调和浓郁。

LHS共检测到37种香气成分，主要由酸、酮、醇、醛和酯类构成。其中酸类有5种，相对含量为22.38%，其次是酮类21.42%、醇类19.25%和醛类4.34%。和LBS1相比，LHS中丁酮类和醛类的含量略低。但因LHS中乙酸、己酸和辛酸等酸类所占的相对含量最大，它们的沸点低，挥发浓度高，对LHS香气影响较大，而挥发浓度低的酮类和醛类对LHS的影响则相对较小，酸类所呈现的尖酸和酪香强于醛酮类[16]。在LHS中，乙醛与丁二酮的含量比为0.286，低于文献[22]所确定的量比范围。LHS主要呈现豆乳的发酵清甜香、脂香，但带有较刺激的酸味。

LBS2共检测到34种香气成分，主要由醇、酮、酸和醛类构成，其中醇类相对含量为22.70%、酮类16.35%、酸类13.76%和醛类5.20%。在LBS2的香气成分中也含有呈甜香的丁酮类以及具有刺激味的乙酸等，但与LBS1、LHS相比，它们的含量相对最低，而阈值较低的正己醇、1-辛烯-3-醇和2-戊基呋喃的相对含量最高，它们占总香气成分的41.48%，这些醇和呋喃物质呈浓郁的大豆青腥气[6]。说明此混合菌种还不能很好适应豆乳的发酵，可能没有将豆乳中的豆腥味化合物转化为酮酸类，结果只呈现微弱的发酵香。

上述分析表明，3种酸豆乳的香气主要由清甜香、果香和脂香构成，它们的香气构成成分、数量和相互比例不同，其呈现的发酵香气强度不同。LBS1中酮类的相对含量较大，且主要香气种类量比协调，其具有浓郁的清甜香和奶油香；其次是LHS，其醛酮类含量居中，具有正常的发酵清甜香气，但因酸类含量过高而带有刺激、尖酸气息；LBS2中酮和酸类的相对含量最低，而醇类和呋喃含量最高，其清甜香淡薄，青香突出，发酵香气最弱。

2.3 发酵菌种对酸豆乳香气强度的影响

表3 不同酸豆乳的感官评分结果Table3 Results of sensory evaluation results of different soymilk yogurts

方差分析结果：

结果表明，在α＝0.05水平上，酸豆乳之间的差异显著，品评员之间的差异也显著。

进一步采用LSD(least significant difference)检验不同酸豆乳分数平均值之间的差异。而LBS1、LHS和LBS2的分数平均值分别为9.38、7.15和3.92，任意两种酸豆乳之间分数平均值的差值均大于0.454，表明任意两者之间差异显著，且按照香气由强到弱排序为LBS1＞LHS＞LBS2。结果说明豆乳经过发酵后其产生的一些香气物质的种类、含量及其相互比例对酸豆乳的香气有显著影响，且不同菌种组合发酵所得酸豆乳的香气强度存在显著差异。这与发酵酸豆乳的香气分析结果及Buono等[24]、Pinthong等[25]和马永昆[26]的研究结果相吻合，即豆乳发酵时，采用1:1的L.bulgaricus和S.thermophilus发酵得到的酸豆乳的风味最佳。

3 结 论

3.1 经SPME-GC-MS检测分析，豆乳有31种香气成分，它们由醇、醛、酮、酸、酯类和呋喃构成，其中以醇、醛类为主，含量分别占45.34%和24.12%。酸豆乳LBS1、LHS和LBS2分别测出36、37、34种香气成分，它们由酮、酸、醇、醛和酯类构成，以酮、酸、醇和醛类为主，其中酮类占16.35%～23.28%，酸类占13.76%～22.38%，醇类占18.48%～22.70%，醛类仅占4.34%～5.56%。豆乳与发酵酸豆乳的香气在种类和含量上有明显差异。

3.23 种发酵酸豆乳的香气主要由清甜香、脂香和特有的乳酸发酵香构成，它们香气的构成成分、含量和相互比例不同导致其呈现不同的发酵香气。进行发酵酸豆乳感官评价，并按照发酵香气由强到弱的排序为LBS1＞LHS＞LBS2， 即由1:1的L.bulgaricus和S.thermophilus组成的菌种产香浓郁，产酸力高，是豆乳发酵的优选菌种。

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Determination and Evaluation of Volatile Components of Soymilk Yoghurts Fermented by Lactic Acid Bacteria

ZHANG Jia1，MA Yong-kun1,2,*，CUI Feng-jie1，CHEN Fan1，SUN Le-liu2，XIA Rong2
(1. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China；2. Biological Processing and Separation Engineering Technology Research Center of Jiangsu Province, Zhenjiang 212004, China)

The volatile components of the soymilk yoghurts fermented by Streptococcus thermophilus plus Lactobacillus bulgaricus (1:1 or 1:2 mixing ratio) or Lactobacillus helveticus (1:1 mixing ratio) were analyzed using headspace solid phase microextraction (SPME) combined with gas chromatograph/mass spectrometer (GC-MS) and sensory evaluation was conducted for these yoghurt samples. The effects of different species of Lactobacillu and mixing ratio for Lactobacillu and Streptococcus thermophilus on the volatile components of soymilk yoghurts were explored. In comparison with pre-fermented soymilk, all the three soymilk yoghurts showed significantly higher contents of ketones and acids but significantly lower contents of aldehydes and alcohols. The contents of the key flavor compounds found in all of them were different. The results of evaluation were consistent with those of aroma composition analysis. The soymilk yoghurt produced with Streptococcus thermophilus plus Lactobacillus bulgaricus at 1:1 mixing ratio had strong aroma and high acidity. Therefore, an excellent fermentation starter has been found for the production of soymilk yoghurt through this study.

lactic acid bacteria；soymilk yoghurt；SPME；GC-MS；aroma

TS214.2

A

1002-6630(2010)20-0298-05

2009-12-29

江苏大学高级人才专项(1283000126)

张佳(1982—)，女，硕士研究生，研究方向为食品发酵与风味。E-mail：zhang99jia@163.com

*通信作者：马永昆(1963—)，男，教授，博士后，研究方向为食品非热加工、食品风味化学与食品发酵工程。E-mail：mayongkun@ujs.edu.cn