肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白对佐剂性关节炎大鼠滑膜中TNF-α、HIF-1α和VEGF表达的影响

徐育冬 靳洪涛 宋新梅 张绍君

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性进行性自身免疫性疾病，以关节滑膜炎，对称性和破坏性关节病变为主要特征［1］。血管新生促进滑膜血管翳的发生和发展，维持血管翳的侵袭性，促进软骨和骨破坏及关节重构，最终造成关节畸形、强直和功能丧失。缺氧诱导因子-1(HIF-1)、血管内皮生长因子(VEGF)是促进血管新生的关键因子，可能在RA发病机制中起重要作用。在细胞因子相互作用的网络中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)居于中心位置，是RA滑膜炎发生和持续的一个关键性因子［2］。本试验以佐剂诱导的关节炎大鼠模型为基础，观察肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(益赛普)对关节炎的影响，评价其疗效，探讨益赛普治疗RA的机制、临床应用价值及其对滑膜组织血管增生的抑制情况。

1 材料与方法

1．1 动物与试剂 Wistar大鼠90只，雄性，体重140～160 g，由河北省实验动物中心提供，合格证号 802120，许可证号SCXK(冀)2003-1-003。

完全弗氏佐剂(FCA，10 ml)购于 Sigma公司，卡介苗(BCG，50 mg/支)购自华瑞创新生物科技开发中心。TNF-α免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物制品公司，VEGF免疫组化成套试剂盒购自晶美生物制品公司。

1．2 分组及AA大鼠模型的建立 将90只雄性Wistar大鼠采用数字表法随机分为5组，分别编号Ⅰ～Ⅴ组，Ⅰ组10只，Ⅱ～Ⅴ组每组20只。Ⅰ组为正常对照组，Ⅱ组为单纯造模组，Ⅲ组为造模+甲氨喋呤组，Ⅳ组为造模 +益赛普低剂量组(0．44 mg/kg)，Ⅴ组为造模 +益赛普高剂量组(0．88 mg/kg)。将FCA与卡介苗配置为含BCG 10mg/ml的水包油乳剂。试验第1天在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组大鼠的尾根部皮内注射该乳剂0．2 ml致炎，诱发佐剂性关节炎。而Ⅰ组大鼠的尾根部皮内注射等量0．9%氯化钠溶液。

1．3 给药 于致炎后第12～23天Ⅳ、Ⅴ组皮下注射益赛普，Ⅳ组予 以 益 赛 普 0．44 mg· kg－1· d－1，Ⅴ 组 予 以 益 赛 普0．88 mg·kg－1·d－1。给药容积均为 0．1 ml/100 g，连续12 d。Ⅲ组大鼠给予甲氨喋呤2．7 mg/kg灌胃，Ⅱ组大鼠给予蒸馏水灌胃0．5 ml·只－1·d－1;给药时间均固定在每天上午 9∶00。

1．4 测量足体积及关节炎指数(AI)的评定 于实验的第0、3、6、9、12、15、18、21、24、27 天用排水法测右足体积，分别测量 3次，取平均值。根据关节红肿程度进行 AI的评定，标准［3］如下:0分:无关节炎;1分:个别足趾发红、肿胀;2分:大部分足趾及足底肿胀;3分:踝关节以下肿胀;4分:肿胀累及踝关节以上，不能负重;AI=四肢关节评分之和。

1．5 病理学及免疫组织化学检测 于致炎后第28天，处死所有大鼠并取膝关节滑膜组织，置于4%多聚甲醛固定液中固定，以备作病理及免疫组织化学检测。常规HE染色并计算滑膜病理积分，按照程度不同分别评分［4］:0分:正常;1分:极少炎性细胞浸润或(和)组织轻微水肿;2分:轻微浸润;3分:中等浸润;4分:明显浸润;5分:严重浸润。免疫组化检测用SABC(链霉亲和素生物素酶复合物)法，TNF-α、HIF-1α和VEGF阳性滑膜细胞均呈颗粒状棕黄色或棕褐色。采用真彩色图像分析系统对TNF-α、HIF-1α和VEGF表达强度进行定量分析。方法［5］如下:每张切片随机选取5个视野(×200)，系统自动测量出阳性染色部位的积分光密度(IOD)，5个视野的平均IOD值代表该切片TNF-α、HIF-1α和VEGF的表达情况。

1．6 统计学分析应用SPSS 13．0统计软件，计量资料以¯x±s表示，采用单因素方差分析，相关性采用直线相关分析，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 Ⅱ～Ⅴ组大鼠造模后共有38只于第15～19天先后出现关节红、肿等关节炎表现，给药期间Ⅱ组死亡1只，Ⅲ、Ⅳ组各有1只受伤，剔出死亡、受伤及造模不成功的大鼠后，最终入选实验统计结果的实验动物共计45只，Ⅰ、Ⅱ组各10只，Ⅲ、Ⅳ组各9只，Ⅴ组7只。

2．2 AI值及足体积的测定 Ⅰ组大鼠无足爪肿胀，各时间点AI值均为0分，Ⅱ～Ⅴ组大鼠AI值均高于Ⅰ组，差异有统计学意义(P＜0．05)。造模后第21～27天Ⅴ组大鼠的AI值明显低于Ⅱ组，差异有统计学意义(P ＜0．05)，而Ⅲ、Ⅳ组AI值虽然均低于Ⅱ组但差异无统计学意义(P＞0．05)。Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组两两之间在各时间点AI值差异无统计学意义(P＞0．05)。见表1。

表1 4组大鼠在不同时间段AI值比较

2．3 各组不同时间段右足体积比较 试验前5组大鼠之间右足体积差异无统计学意义(P＞0．05)。Ⅱ～Ⅴ组大鼠右足体积于造模后第15天开始明显增高，与Ⅰ组比较，Ⅱ组于造模后第15天足肿胀程度明显增高(P ＜0．05或＜0．01);Ⅲ～Ⅴ组于造模后第18天足爪肿胀程度明显增高(P＜0．05)，并于第21～24天逐渐达肿胀高峰，除Ⅳ组外，Ⅲ、Ⅴ组于第27天足肿胀程度均略好转，但与Ⅰ组比较差异仍有统计学意义(P＜0．05)。与Ⅱ组比较，Ⅲ组虽然足肿胀程度低但差异无统计学意义(P＞0．05)，Ⅳ组于第21～24天足体积明显低于Ⅱ组(P＜0．05)，但第27天与差异无统计学意义(P ＞0．05);Ⅴ组于第21～27天足体积均明显低于Ⅱ组(P＜0．05)。Ⅴ组于给药12 d后足体积明显低于Ⅲ组(P＜0．05);Ⅲ组与Ⅳ组、Ⅳ组与Ⅴ组差异均无统计学意义(P＞0．05)。见表2。

表2 5组大鼠不同时间段右足体积比较ml，x¯±s

2．4 大鼠滑膜病理学改变及病理学评分 Ⅰ组正常大鼠滑膜衬里层有1～2层滑膜细胞组成，且部分不连续。滑膜衬里层下层为由脂肪细胞、少量成纤维细胞、巨噬细胞和少量血管组成的结缔组织。滑膜组织无炎性细胞浸润，无纤维组织增生。Ⅱ组可见滑膜组织中等量淋巴细胞、单核细胞及中性粒细胞浸润，平均病理积分3．8±0．4，滑膜衬里层增生达4～6层。Ⅲ～Ⅴ组滑膜组织病理积分均明显低于Ⅱ组，差异有统计学差异(P＜0．01);Ⅴ组滑膜组织病理积分低于Ⅲ组(P ＜0．05);Ⅳ组滑膜组织病理积分与Ⅲ、Ⅴ组之间差异无统计学意义(P＞0．05)。见表 3。

表3 大鼠膝关节滑膜病理学积分±s

表3 大鼠膝关节滑膜病理学积分±s

注:与Ⅲ组比较，*P ＜0．05;与Ⅱ组比较，#P ＜0．01

积分Ⅰ组(n=10)组别0Ⅱ组(n=10) 3．8 ±0．4Ⅲ组(n=9) 2．8 ±0．8#Ⅳ组(n=9) 2．4 ±0．6#Ⅴ组(n=7) 2．0 ±0．7*#

2．5 滑膜组织TNF-α、HIF-1α和 VEGF的表达 Ⅰ组大鼠滑膜组织有少量TNF-α、HIF-1α和VEGF的表达。与Ⅰ组比较，Ⅱ～Ⅴ组均明显增高(P ＜0．01)。与Ⅱ组比较，Ⅳ、Ⅴ组滑膜组织TNF-α表达明显减低，差异有统计学意义(P ＜0．01);Ⅲ组TNF-α表达虽低于Ⅱ组，但差异无统计学意义(P＞0．05);Ⅲ～Ⅴ组滑膜组织HIF-1α、VEGF的表达均明显低于Ⅱ组(P＜0．01)。Ⅳ、Ⅴ组滑膜组织TNF-α 表达低于Ⅲ组(P ＜0．05)，Ⅴ组滑膜组织TNF-α表达低于Ⅳ组(P＜0．05)。Ⅲ、Ⅳ组滑膜组织HIF-1α、VEGF的表达均高于Ⅴ组(P ＜0．05);Ⅲ与Ⅳ组之间差异无统计学意义(P ＞0．05)。见表4、图1～8。

表4 5组大鼠膝关节滑膜组织TNF-α、HIF-1α和VEGF IOD值比较/μm2，¯±s

表4 5组大鼠膝关节滑膜组织TNF-α、HIF-1α和VEGF IOD值比较/μm2，¯±s

注:与Ⅰ组比较，*P ＜0．01;与Ⅱ组比较，#P ＜0．01;与Ⅲ组比较，△P ＜0．05，与Ⅳ组比较，☆P ＜0．05

VEGFⅠ组(n=10)组别 TNF-α HIF-1α 237±48 177±51 193±14Ⅱ组(n=10) 1 105±186* 1003±238* 1030±248*Ⅲ组(n=9) 1 053±129* 794±115*# 668±129*#Ⅳ组(n=9) 835±109*#△ 739±134*# 641±108*#Ⅴ组(n=7) 661±84*#△☆ 510±105*#△☆ 440±62*#△☆

2．6 滑膜病理学评分与 TNF-α、HIF-1α和VEGF表达的相关性 滑膜组织TNF-α、HIF-1α和VEGF的IOD值分别与病理积分成直线正相关(r=0．872，P ＜0．01;r=0．810，P ＜0．01;r=0．778，P ＜0．01)。

3 讨论

益赛即注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，是一种可抑制TNF-α功能的生物制剂。目前益赛普抗炎疗效的可能的机制包括:(1)减少炎症部位的细胞生成;(2)下调滑膜细胞因子的表达;(3)降低血浆MMP-1和MMP-3的水平;(4)可调节细胞的凋亡［6］。有研究结果显示，应用益赛普治疗的RA患者关节炎症明显好转。HIF-1α和VEGF在血管新生的病理和生理中炎症具有重要作用。HIF-1α是缺氧状态下血管生成的核心调控因子，可上调VEGF表达。研究显示，在体内TNF-α启动VEGF生成以促进血管新生，抗TNF-α治疗可降低VEGF生成及与RA相关的血管新生，使增生血管复原［7，8］。抗TNF-α制剂，在体外培养的滑膜细胞可抑制VEGF生成［9］。本实验显示，益赛普可抑制滑膜组织TNF-α、HIF-1α和VEGF的过度表达，且和足体积、关节炎指数均呈直线正相关。益赛普治疗组滑膜组织TNF-α的表达低于单纯造模组，而甲氨喋呤组与单纯造模组差异无统计学意义，说明益赛普可降低滑膜组织TNF-α的表达。益赛普治疗组滑膜组织HIF-1α、VEGF的表达

图1 正常滑膜组织(HE×400)

图3 TNF-α在正常大鼠滑膜的表达(免疫组化 ×400)

图4 TNF-α在 AA大鼠滑膜的表达(免疫组化×400)

图7 HIF-1α在正常大鼠滑膜的表达(免疫组化 ×400)

图8 HIF-1α在AA大鼠滑膜的表达(免疫组化×400)

图5 VEGF在下正常大鼠滑膜的表达(免疫组化×400)

图6 VEGF在AA大鼠滑膜的表达(免疫组化×400)

图2 增生滑膜组织(HE×400)均明显低于单纯造模组，高剂量组明显低于甲氨喋呤组，而低剂量组与甲氨喋呤组无统计学差异。说明益赛普可以降低AA大鼠滑膜组织HIF-1α、VEGF的表达，抑制新生血管形成，从而减少血管翳的形成。益赛普治疗组大鼠滑膜组织病理积分均明显低于单纯造模组;高剂量组明显低于甲氨喋呤组，而低剂量组与甲氨喋呤组差异无统计学意义。说明益赛普可以有效抑制或延缓AA大鼠关节病理改变，减轻关节病变程度且成剂量依赖性。与甲氨喋呤治疗组比较，益赛普高剂量组在足体积、AI、TNF-α、HIF-1α和VEGF在滑膜的表达、滑膜病理积分均明显降低，而低剂量组与甲氨喋呤组差异无统计学意义(P＜0．05)，说明益赛普起效早于甲氨喋呤，近期效果优于甲氨喋呤，这可能与给药方法不同，以及甲氨喋呤起效缓慢有关，但远期疗效尚有待观察。

本实验说明:经益赛普治疗的AA大鼠，从足肿胀程度、滑膜TNF-α、HIF-1α和VEGF水平、滑膜病理积分几方面均显著低于未经治疗的AA大鼠，近期疗效优于甲氨喋呤，其机制可能与益赛普中和TNF-α，抑制了TNF-α促炎因子的作用，从而间接抑制了对血管翳形成直接造成软骨和骨破坏起主要作用的HIF-1α、VEGF的表达有关。

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2 Tracey D，Klareskog L，Sasso EH，et al．Tumor necrosis factor antagonist mechanisms of action:A comprehensive review．Pharmacology＆ Therapeutics，2008，117:244-279．

3 Baharav E，Mor F，Halpern M，etal．Lactobacillus GG Bacteria Ameliorate Arthritis in Lewis Rats．JNutr，2004，134:1964-1969．

4 张晶，左晓霞，李通，等．沙利度胺对大鼠佐剂性关节炎的治疗作用及其对炎性细胞因子的影响．中华风湿病学杂志，2005，9:656-659．

5 Peters CL，Morris CJ，Mapp PI，et al．The Transcription Factors Hypoxia-Inducible Factor 1αand Ets-1 Colocalize in the Hypoxic Synovium of Inflamed Joints in Adjuvant-Induced Arthritis．Arthritis Rheumm，2004，50:291-296．

6 Baier A，Meineckel I，Gay S，et al．Apoptosis in rheumatoid arthritis．Curr Opin Rheumatol，2003，15:274-279．

7 Roccaro AM，Russo F，Cirulli T，et al．Antiangiogenesis for Rheumatoid Arthritis．Current Drug Targets-Inflammation Allergy，2005，4:27-30．

8 Agarwal A，Panda S，Misra R．Effectof etanerceptonmatrixmetalloproteinases and angiogenic vascular endothelial growth factor:a time kinetic study．Ann Rheum Dis，2004，63:891-892．

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