p53及耐药相关基因的表达与非小细胞肺癌化疗耐药性的研究

孙 超,时会云,袁东朋

(东海县人民医院胸外科,江苏 东海 222300)

化疗是肺癌非手术治疗的一线选择,研究证实以顺铂为基础的联合化疗是治疗进展期非小细胞肺癌(NSCLC)的基本方案,但有效率亦仅 25%-30%,化疗反应率低与肿瘤细胞对联合化疗产生原发或继发性耐药有关[1]。随着对肿瘤发生及联合化疗分子机制的认识,已证实一些肿瘤分子标志的改变与化疗敏感性有关,如:P-糖蛋白 (P-glycoprotein,P-gp)、多药耐药相关蛋白 (Multidrug resis-tance-associated protein,MRP)、肺耐药相关蛋白(Lung resistance-associated protein,LRP)、谷胱甘肽转移酶(Glutathione-S-transferase-pi,GST-π)等多种耐药相关的酶和蛋白。近年来研究发现p53基因异常也在肿瘤细胞耐药性的产生中扮演了重要角色[2]。p53基因是影响细胞周期阻滞和凋亡过程的重要分子事件,细胞周期和凋亡异常又与肿瘤耐药密切相关。本研究旨在总结突变型 p53蛋白和 4种耐药相关蛋白的表达情况,以明确肺癌细胞中 p53突变与化疗耐药性产生的相关性,了解其表达的一般规律和特点,为临床个体化选用合理的化疗药物提供客观的实验依据。

1 资料与方法

1.1 材料来源 60例 NSCLC组织均取自2003年 5月至 2009年 10月在我院经纤维气管镜活检或手术切除肺癌组织。活检前均未行全身及局部化疗和放疗,活检后均根据不同的病理类型给予化疗。其中男 39例,女 21例;年龄 30-71岁,平均 53岁。其中鳞癌 41例,腺癌 19例。分化程度:高分化20例,中分化 23例,低分化 17例。TNM分期:Ⅰ -Ⅱb期 9例,Ⅲ a期 12例,Ⅲ b期 13例,Ⅳ期 26例。根据胸部 CT检查,有纵隔淋巴结肿大者 27例,无肿大者 33例。所有患者术后或活检后均接受至少两个周期的化疗,化疗结束后 5-7 d拍胸片,观察化疗效果并评定疗效。疗效根据 WHO标准确定,达完全缓解或部分缓解者为疗效有效,稳定或进展者为疗效无效。取患者健侧相应部位的支气管黏膜为对照。

1.2 免疫组织化学染色及结果判定 鼠抗人P-gp、MRP、LRP、GST-π、突变型 p53单克隆抗体及 SP免疫组化试剂盒、DAB显色剂试剂盒,均购于北京中杉生物技术开发公司。免疫组化染色:标本均经 10%中性甲醛固定,常规石蜡包埋,4μm连续切片,50℃恒温箱中固定脱水 24 h,梯度二甲苯脱蜡水化,其余步骤按照 SP免疫组化试剂盒说明书进行,DAB显色,苏木素复染,中性树胶固封。使用已知阳性片作为阳性对照,用 PBS代替一抗作为阴性对照。P-gp表达位于细胞膜,MRP、LRP、GST-π表达均位于细胞膜和∕或细胞浆,p53表达位于细胞核,阳性反应为棕黄色颗粒;每张切片在高倍镜下(×400)随机计数 10个视野,计算其阳性率。判断标准:整张切片均无着色或偶有浅黄色细胞但阳性细胞数 ＜5%为阴性(-),10%-25%为阳性(+),25%-75%为(++),＞75%为(+++);耐药基因相关蛋白阳性表示肿瘤对该耐药基因所介导的药物具有耐受性。

1.3 统计学处理 采用 SPSS 13.0软件进行卡方检验分析相关数据,P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 肺癌组织各基因的表达情况 P-gp在癌细胞的细胞膜呈弥漫性表达,MRP、LRP、GST-π在肺癌组织的细胞膜和∕或细胞浆呈弥漫性或灶性分布,p53则在细胞核呈阳性表达。具体结果见表1。

表1显示:(1)60例 NSCLC中 P-gp阳性表达32例(53.3%),MRP阳 性 表 达 30例(50.0%),LRP阳性表达 45例(75.0%),GST-π阳性表达 44例 (73.3%),p53阳性表达 41例 (68.3%)。(2)LRP在腺癌中表达最高,p53在鳞癌中表达最高,P-gp、MRP1和 GST-π在腺癌与鳞癌中表达率相差不大。x2检验分析表明,P-gp的表达为腺癌 ＞鳞癌,但差异无统计学意义(P＞0.05);MRP的表达为鳞癌 ＞腺癌,但差异无统计学意义(P＞0.05);GST-π的表达腺癌和鳞癌相当,差异无统计学意义(P＞0.05);LRP的表达为腺癌 ＞鳞癌,且差异有统计学意义(P＜0.05);p53的表达为鳞癌 ＞腺癌,差异亦有统计学意义 (P＜0.05)。(3)突变型 p53的表达与肿瘤细胞分化程度相关,其表达随着肿瘤分化程度的升高而呈递减趋势,高分化组 p53的表达明显低于中、低分化组(P＜0.05)。其余 4种耐药相关蛋白的表达与肿瘤的分化程度无显著相关性(P＞0.05)。(4)有淋巴结转移的患者p53表达水平明显高于无淋巴结转移的患者,差异有统计学意义(P＜0.05),且 p53表达与肿瘤 TNM分期相关,肺癌从Ⅰ期到Ⅳ期,其表达逐渐升高。其余 4种蛋白在不同 TNM分期及有无淋巴结转移的患者中表达差异均无统计学意义(P＞0.05)。

表1 P-gp、MRP、LRP、GST-π和 p 53蛋白在 NSCLC中的表达[例(%)]

2.2 p53及耐药相关蛋白的共表达现象 60例中有 p53和一种或一种以上耐药相关蛋白表达阳性,表达率达 94.8%,其中 21例 4种耐药相关蛋白表达均为阳性,表达率达 35.0%。p53与 P-gp、GST-π间的表达有相关性,Spearman等级相关分析也显示 p53与 P-gp、GST-π的表达呈正相关(P＜0.05),表达率分别为 71.2%和 51.7%。p53与LRP、MRP的表达无明显相关性(P＞0.05),见表 2。

表2 p53蛋白与各耐药相关蛋白表达的相关性

2.3 p53及耐药相关蛋白的表达与 NSCLC临床化疗疗效的关系 患者均接受含铂化疗方案,以EP、MVP、NP方案为主,总有效率为 56.67%(34/60),本研究中 60例患者均有完整随访资料,生存期计算自化疗或手术首日始至死亡或失访日止。中位随访时间为 35个月,其中 39例死亡。p53蛋白的表达与化疗疗效显著相关,p53阴性化疗有效率为60.5%,p53阳性化疗有效率只有 28.3%(P＜0.05)。部分患者虽然 p53蛋白表达阴性,但化疗效果不明显,分析原因为这部分患者有 P-gp、MRP、LRP、GST-π基因一种或多种共表达,致其对含铂方案不敏感。p53阳性表达者不同化疗方案有效率分别为 EP 22%,MVP 27%,NP 33%,x2检验显示,与不同化疗方案之间 p53蛋白的表达无显著相关(P均 ＞0.05)。

3 讨 论

肿瘤细胞产生耐药性是目前抗肿瘤化疗失败的主要原因之一。产生耐药性的肿瘤细胞不仅对使用过的抗肿瘤药物产生耐药,而且对多种未曾用药物治疗的肿瘤和作用机理不同的药物也产生耐药,这种现象称为多药耐药性(Multi drug resistance,MDR)。事实上,肿瘤化疗的耐药性常常是多种耐药蛋白参与及不同机制共同作用的结果。多药耐药基因是一个大家族,研究比较肯定的有 P-gp、MRP、LRP、GST-π、Topo-Ⅱ等,其中 P-gp被认为是介导肿瘤多药耐药的最主要机制[1-2]。有研究认为,MDR基因的过度表达除了肿瘤进展过程中肿瘤细胞自身产生外,还与体内有害物质和代谢产物的长期刺激、化疗药物诱导以及多种基因调节效应有关[3]。最近研究表明,许多临床常用的肿瘤化疗药物均能诱导肿瘤细胞凋亡,凋亡可能是多数化疗药物细胞毒作用的最终共同途径,而参与凋亡过程调控的 p53、Bcl-2等基因的表达失控可能导致肿瘤细胞对多种化疗药物耐受[4]。随着肺癌 MDR研究的扩展和深入,人们越来越多地关注到细胞凋亡相关基因在 MDR中的作用。

野生型 p53基因作为一种抑癌基因,在细胞周期的调控和诱导凋亡中起重要作用,Chin等[5]认为,突变后的 p53可能会激活 MDR-1基因的启动因子,诱导 MDR-1基因的复制,使肿瘤细胞对化疗的敏感性大大降低。本研究中,p53与 P-gp、GST-π的表达存在明显相关性。p53蛋白的积聚作为NSCLC患者化疗的负相关性预后指标,提示肿瘤细胞中 p53蛋白的状态同样是对化疗反应一个颇为重要的因素。

本研究结果显示,60例 NSCLC中 P-gp阳性表达 32例(53.3%),MRP阳 性 表 达 30例(50.0%),LRP阳性表达 45例(75.0%),GST-π阳性表达 44例 (73.3%),p53阳性表达 41例 (68.3%),提示p53及 4种耐药相关蛋白中肺癌组织中高表达导致肿瘤组织的耐药,这与有关报道相符[6]。同时 LRP和 P-gp在腺癌中表达要高于鳞癌,临床上鳞癌比腺癌对化疗敏感,而腺癌对化疗存在普遍耐药性亦与本结果相符;MRP和 GST-π的表达在腺癌和鳞癌无明显差异 (P＞0.05)。p53在鳞癌中表达显著高于腺癌,差异有统计学意义 (P＜0.05);且 p53的表达与肿瘤细胞分化程度及 TNM分期相关,其表达随着肿瘤分化程度的升高而呈递减趋势,肺癌从Ⅰ期到Ⅳ期,其表达也是逐渐升高的。

60例中有p53和一种或一种以上耐药相关蛋白共表达率达 94.8%,其中 21例 4种耐药相关蛋白表达均为阳性,共表达率达 35.0%。患者化疗以 EP、MVP、NP方案为主,总有效率为 56.67%,p53蛋白的表达与化疗疗效显著相关,p53阴性者化疗有效率(60.5%)明显高于 p53阳性者(28.3%)。部分患者虽然 p53蛋白表达阴性,但化疗效果不理想,分析其原因可能为这部分患者有 P-gp、MRP、LRP、GST-π基因一种或多种共表达,致其对含铂方案不敏感。这表明 P-gp、MRP、LRP、GST-π不同程度地同时参与了肿瘤的耐药形成,表达上的差异性与不一致性也正说明了影响肿瘤耐药机制的多因素性。因此,联合检测肿瘤多个耐药相关标志,同时评估多个耐药基因的表达,能更加客观地反映肿瘤的耐药情况。临床上可依据耐药机制的不同,筛选出产生耐药可能性最小的联合化疗方案,优化组合,增强疗效。

目前临床医师制定化疗方案一般根据经验用药或参考教科书,具有盲目性和不科学性。从本研究结果可看出,耐药基因在不同个体中表达有很大差异,结合耐药基因蛋白的作用机制与化疗药物的作用特点,针对个人选择敏感的化疗药物是十分必要的。例如,顺铂是现今临床上肺癌化疗方案中必不可少的一线药物,但不同肺癌患者 P-gp、MRP、LRP、GST-π等的表达却不尽相同,如果按部就班使用传统的化疗方案,结果将不能高效地杀死肿瘤细胞,同时这也解释了临床上同一方案化疗效果的不一致性。因此化疗前综合检测患者肿瘤组织的p53及耐药相关蛋白表达情况意义更大[7]:一方面,揭示肿瘤耐药、复发的分子机制,估计化疗效果和判断预后;另一方面,依据其固有耐药机制来指导化疗,制定有效的个体化疗方案;再者,可依据耐药机制的不同,应用逆转剂增强化疗疗效,提高非小细胞肺癌患者的有效生存期。野生型 p53基因替代治疗并联合化疗可能是增强肺癌化疗疗效的有希望途径。多种化疗药物敏感实验、p53基因突变及多种耐药基因表达的检测,对于化疗效果的预测、个体化化疗方案的制定具有重要的意义。

[1] Oue T,Yoneda A,Uehara S,et al.Increased expression of multidrug resistance-associated genes after chemotherapy in pediatric solid malignancies[J].JPediatr Surg,2009,44(2)∶377-380.

[2] Tucci M,Quatraro C,Dammacco F,et al.Role of active drug transporters in refractory multiple myeloma[J].Curr Top Med Chem,2009,9(2)∶218-224.

[3] Minderman H,Zhou Y,O'Loughlin KL,et al.Bortezomib activity and in vitro interactions with anthracyclinesand cytarabine in acute myeloid leukemia cells are independent of multidrug resistance mechanisms and p 53 status[J].Cancer Chemother Pharmacol,2007,60(2)∶245-255.

[4] Yakirevich E,Sabo E,Naroditsky I,et al.Multidrug resistancerelated phenotype and apoptosis-related protein expression in ovarian serous carcinomas[J].Gynecol Oncol,2006,100(1)∶152-159.

[5] Chin KV,Kong AN.Application of DNA microarrays in pharmacogenomics and toxicogenomics[J].Pharm Res,2002,19(12)∶1 773-1 778.

[6] Li QQ,Xu JD,Wang WJ,et al.Twist1-mediated adriamycin-induced epithelial-mesenchymal transition relates to multidrug resistance and invasive potential in breast cancer cells[J].Clin Cancer Res,2009,15(8)∶2 657-2 665.

[7] Brooks KR,To K,Joshi MB,et al.Measurement of chemoresistance markers in patientswith stage IIInon-small cell lung cancer:a novel approach for patient selection[J].Ann Thorac Surg,2008,76(1)∶187-193.