参芪扶正注射液对轮状病毒感染性肠炎小鼠血清 IL-2、INF-γ的影响

李文英,傅万海,陈国新,梁 剑

(1.广东省第二人民医院儿科,广东 广州 510317;2.广州市天河区中医院儿科,广东 广州 510655)

人轮状病毒(Human Rotavirus,HRV)感染引起儿童腹泻常发生在秋冬季,发病率高,传染性强,病情凶险,是发展中国家小儿死亡的主要疾病。目前全世界还未发现特效的治疗药物,仅限于补液和调节酸碱平衡,但效果皆不尽人意。中医方面也有口服验方治疗该病的报导,但婴幼儿存在口服中药的困难,特别是伴有呕吐和中重度脱水的患儿更难吸收。我们自 2002年以来,在临床上静脉使用参芪扶正注射液配合常规补液治疗轮状病毒感染性腹泻取得了较显著的疗效。为了从理论角度明确参芪扶正注射液对轮状病毒肠道感染后机体免疫功能的影响,我们在 2008年 11月至 2009年 8月间进行了相关动物实验,以小鼠 HRV感染模型研究了参芪扶正注射液治疗轮状病毒感染时机体免疫功能的变化,现将结果报道如下:

1 材料与方法

1.1 实验动物及病毒 BLAB/C健康小鼠 80只,由南方医科大学实验动物中心提供。将实验小鼠随机分为正常组、模型组、病毒唑组和参芪扶正注射液治疗组,每组各 20只。实验前所有小鼠大便RV抗原经胶体金法检测呈阴性。HRV细胞悬液,由中国医学科学院病毒研究所提供。

1.2 实验药物及试剂 参芪扶正注射液成份为黄芪、党参,由丽珠集团利民制药厂生产,每瓶 250 ml。病毒唑为广东江门制药厂产品,100 mg/ml(批号:000706)。粪便 HRV抗原检测试剂盒由上海名碘生物工程公司提供;IL-2、IFN-γ检测试剂盒由深圳晶美生物工程有限公司提供。

1.3 感染造模 除正常对照组外均按 Schoub[1]方法将滴度为 4.4×105pfu/只 0.1 ml HRV悬液经口感染小鼠。正常对照组给等量生理盐水(NS)。病毒接种后,各组隔离饲养观察。12 h后收集每只小鼠粪便。

1.4 判断小鼠是否感染轮状病毒 病毒接种后 1-4 d摩腹收集小鼠大便,放入 EP管于 -80℃保存备用,胶体金法检测 RV抗原。

1.5 给药方式 其中参芪扶正注射液治疗组用极细小尼纶管经口滴入参芪扶正注射液 0.1 ml/(只◦次),3次/d,连续给药 7 d。病毒唑组用同样方法滴入病毒唑,0.1 ml/(只◦次),3次/d,正常组与模型组均滴入等量细胞培养液,连续 7 d。

1.6 临床观察及标本的留取 每天观察记录各组动物的临床表现(大便性状、小鼠的精神状态、毛色、采食状况和体重等)。在末次给药后 24 h各组随机抽取 12只小鼠,每只断颈留血约 0.5 ml,放置于清洁的肝素钠抗凝管内,摇匀,将血液以 4 000 r/min的速度离心 15 min,取血清,-20℃保存备用。同时解剖小鼠,留取肝脏、脾脏、肾脏及小肠,10%甲醛固定待检。

1.7 检测项目

1.7.1 组织病理学检测 各脏器用 10%甲醛固定、脱水、包埋、切片和苏木素 -伊红染色后行病理学检查。

1.7.2 IL-2、IFN-γ表达的测定 采用双抗体夹心 ELISA法检测小鼠血清中 IL-2、IFN-γ的表达,具体操作步骤严格按试剂盒说明进行。

1.8 统计学处理 各组数据以均数 ±标准差(x±s)表示,用 SPSS13.1软件进行统计分析。全部数据经方差齐性分析后,采用单因素方差分析和 t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 临床表现 所有感染组小鼠在接毒后第 2天均出现明显的腹泻症状(大便软、滩不成形,稀便或水样便),第 3-4天症状达到高峰,后逐渐恢复,至第 7天症状有不同程度的消失。正常对照组保持正常情形,体毛平顺,食欲正常,精神活跃,体重正常。

2.2 大便 RV抗原检测 治疗前除正常对照组以外所有小鼠大便 RV抗原检测均呈强阳性。在治疗第 4天,检测各组粪便 RV情况,模型组均阳性(20/20),病毒唑组阳性 11只(11/20),参芪组阳性2只(2/20),正常对照组均阴性(0/20),经统计学处理,参芪组阳性率明显低于模型组,差异有统计学意义(P＜0.05);且低于病毒唑组,差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 组织病理学改变 感染组可见小肠上皮变性脱落,肠绒毛变平,萎缩,肾小体和肾小管上皮轻度空泡变性,其他组织器官未见明显改变。正常对照组各器官未见明显改变。

2.4 血清中 IL-2、IFN-γ的表达情况 参芪治疗组血清 IL-2含量显著高于模型组,差异有统计学意义(P＜0.05);与正常对照组比较差异则无统计学意义(P＞0.05)。参芪治疗组 INF-γ表达含量高于模型组及正常对照组,差异有统计学意义(P＜0.05),但与病毒唑组比较差异则无统计学意义。见表 1。

表1 参芪扶正注射液对 HRV感染小鼠IL-2、INF-γ表达的影响(x±s)

3 讨 论

参芪扶正注射液是采用我国传统补气药物党参、黄芪为主要原料精制而成的纯中药制剂,具有扶正固本、补脾益气之功效。参芪并用具有较好的扶正功效及免疫调节作用[2]。

许多研究发现细胞因子在 RV感染引起的肠道内、外感染发病中起重要作用,在 RV感染早期,细胞免疫应答以 Th1反应为特征,Th1应答优势往往引起感染的痊愈[3],以介导细胞免疫应答为主的 Th1细胞主要分泌 IL-2、IFN-γ等细胞因子,其中 IL-2主要由活化的淋巴细胞产生,是调节机体免疫功能最主要的淋巴因子之一[4]。IL-2能激活多种免疫细胞,诱导淋巴细胞的增生与免疫效应,促进 B细胞的免疫应答以及 NK细胞、单核巨噬细胞的增生[5]。INF-γ是活化的 T淋巴细胞产生的一种具有多潜能的细胞因子,对免疫系统具有重要的调节作用,它不仅能激活巨噬细胞,还能活化 NK细胞,而 NK细胞是构成免疫防御第一道防线的非特异性杀伤细胞,因此 IFN-γ的释放在 RV感染的急性期起保护性作用[6]。

从本研究的实验结果我们可以认为参芪扶正注射液能够改善轮状病毒感染小鼠的腹泻症状,该作用可能通过两个方面的药理作用完成,一方面参芪扶正注射液抑制轮状病毒在小鼠体内的复制从而减少病毒感染导致的腹泻;另一方面经参芪扶正注射液治疗后小鼠血清 IL-2和 INF-γ含量有显著增高,表明参芪扶正注射液可以增强轮状病毒感染小鼠的免疫功能,可能是由促进小鼠 Th1细胞活化所致,当然其具体机制尚待进一步研究。

综上所述,参芪扶正注射液在抑制轮状病毒复制的同时能提高机体细胞免疫功能,使病毒感染所致的细胞免疫水平下降及细胞免疫功能损伤得到较快的恢复,因此临床上可应用于轮状病毒感染且免疫功能低下患儿的治疗。

[1] Schoub BD,Progesky DW.Antiviral Activity of Ribavirin in Rotavirus Gastroemteritis of Mice,Antimicr[J].Agen and Chemotr,1997,12∶543.

[2] 耿维凤,陈 敏.参芪扶正注射液临床初步观察[J].中国医院药学杂志,2003,23(9)∶554.

[3] 徐 锦,杨 毅,孙家娥,等.急性轮状病毒性腹泻患儿免疫应答的观察[J].中华微生物学和免疫学杂志,2006,26(3)∶248-251.

[4] Azevedo M,Yuan L,Pouly S,et al.Cytokine responses in gnotobiotic pigs after infection with virulent or attenuated human rotavirus[J].Jvirology,2006,80(1)∶372-382.

[5] Kim JW,Ferris RL,Whiteside TL.Chemokine C Receptor Expression and Protection of Circulating CD8+T Lymphocytes from Apoptosis[J].Clin Cancer Res,2005,11(21)∶7 901-7 910.

[6] Sugata K,Taniguchi K,Yui A,et al.Analysis of rotavirus antigenemia and extra-intestinal manifestations in children with rotavirus gastroenteritis[J].Pediatrics,2008,122(2)∶392-397.