Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期糖尿病肾病患者血清糖基化终末产物水平影响因素分析

张国欣 徐金升 阮琳 薛兰芬 聂丽敏 潘志兰 牛文明

糖基化终末产物(AGEs)是还原糖(如葡萄糖、果糖及葡萄糖-6-磷酸等酮糖)与蛋白质、氨基酸等的游离氨基酸通过一系列复杂的非酶促反应形成的结构多样的不可逆聚合物［1］。在不同组织中AGEs的聚集可以通过诱发氧化应激等机制导致糖尿病的各种慢性并发症［2］。肾脏是氧化应激反应比较敏感的组织，所以AGEs在糖尿病肾病的发生发展中起着重要作用。本试验探讨了糖化血红蛋白(HbA1c)、血肌酐水平及糖尿病肾病分期对血清AGEs水平的影响，以期为进一步研究AGEs在糖尿病肾病中的作用提供依据。

1 资料与方法

1．1 一般资料 2007年1至9月在我科住院明确诊断糖尿病肾病患者27例，男15例，女12例;平均年龄(64±7)岁;所有患者糖尿病病史＞5年，查眼底均合并视网膜病变，既往无高血压及肾脏病史。按Mogensen的DN分期:Ⅲ期DN患者(尿微量白蛋白30～300 mg/24 h)8例，Ⅳ期DN患者 (尿蛋白定量＞0．5 g/24 h)11例，Ⅴ期未进行血液透析DN患者血肌酐(Scr)＞133 μmol/L［(239±98)μmol/L］8例。

1．2 方法 血清AGEs的检测采用竞争性 ELISA法，由于AGEs存在共同的抗原决定簇，因此，可以用单一AGEs修饰蛋白的抗体检测总AGEs。在多种AGEs修饰蛋白中抗AGERNase抗体能够非选择性地识别所有 AGEs复合物，但与非AGEs修饰的蛋白及Amadori物质不起反应。

1．2．1 标准曲线及标准方程的建立［3］:3 mg/L AGE-Ag 100μl包被96孔板(pH 9．6碳酸氢盐缓冲液)，37℃ 2 h，4℃过夜，封闭1 h(封闭液0．01 mmol/L，PBS-1%BSA，150 μl)，洗3次;加入不同浓度标准 AGE-Ag(分 别 为 100、10、8、4、2、1、0．1 mg/L)和 AGE-Ab各50 μl(1∶1 000)，同时设总对照(不加标准AGE-Ag)和空白对照(不加AGE-Ab)，室温孵育2 h，振荡，洗3 次;加AKP-羊抗兔 IgG(1∶4 000，Sigma)100 μl，37℃孵育1 h，洗6次，稀释液均为0．01mmol/L PBS和0．5%Tween 20和2%山羊血清混合液，清洗液均为0．01 mmol/L PBS和0．5%Tween 20的混合液，均设复孔。最后pNPP底物(Sigma)显色，在405 nm波长下读取A值，至总对照A值在1．2～1．5，计算标准 AGE-Ag A比值 =(标准 A 405-空白 A 405)/(总A405-空白A 405)。各标准浓度AGE-Ag A比值与其浓度之间关系模拟方程 y=1/(1+a×b)，拟合得方程 y=1/(1+0．1170 ×0．7081)。经统计学检验 R=0．9915，R2=0．9830，P ＜0．01。表明通过此方程，标准 A 405值能反映其AGEs水平。

1．2．2 血清AGEs检测:－80℃冰箱保存的DN患者血清标本经1∶5稀释后进行AGEs检测，均设复孔，取其平均A值代入上述方程计算出各标本AGEs水平。

1．3 统计学分析 应用SPSS 10．0统计软件，糖尿病肾病患者AGEs水平采用方差分析，糖尿病肾病患者血清AGEs水平与年龄、性别、HbA1c水平及糖尿病肾病分期之间关系采用多元逐步回归分析，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期组血清AGEs水平两两比较差异有统计学意义(P ＜ 0．05)。见表1。

2．2 2 型糖尿病肾病患者中血肌酐水平正常组与升高组血清AGEs水平分别为(32±7)μg/ml和(43±10)μg/m l，后者较前者显著增高(P＜0．01)。

2．3 对27例2型糖尿病肾病患者进行多元逐步回归分析显示在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期糖尿病肾病患者中血清AGEs水平与分期及HbA1c有关(标准回归系数均为0．548、0．327，P ＜0．05)。

3 讨论

AGEs是还原糖(如葡萄糖、果糖及葡萄糖-6-磷酸等酮糖)与蛋白质、氨基酸等的游离氨基酸通过一系列复杂的非酶促反应形成的结构多样的不可逆聚合物。目前有证据表明AGEs在糖尿病慢性并发症包括大血管病变、微血管病变(糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、糖尿病心肌病等)、神经病变等的发生发展中起着重要作用。检测体内AGEs对临床进一步研究糖尿病慢性并发症的发生、评估并发症的程度、监测长期血糖水平以及指导糖尿病治疗等将具有十分重要的意义［4］。AGEs检测方法包括荧光分析法、放射受体分析法、免疫学方法、高效液相层系(HPLC)等。ELISA法因其操作简便、灵敏度和特异性也很高，有望在临床大规模开展。

表1 在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期2型糖尿病肾病患者血清AGEs水平相关影响因素多元逐步回归分析 μg/m l，±s

表1 在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期2型糖尿病肾病患者血清AGEs水平相关影响因素多元逐步回归分析 μg/m l，±s

注:与Ⅲ期比较，*P ＜0．05;与Ⅳ期比较，#P ＜0．05

变量 AGEs P值年龄(岁)＜65(n=9) 33±6 ＞0．05≥65(n=18) 37±11性别男(n=15) 37±10 ＜0．05女(n=12) 34±9血肌酐水平正常组(n=19) 32±7 ＜0．01增高组(n=8) 43±10 HbA1c(%)＜8(n=10) 30±6 ＜0．01≥8(n=17) 39±10糖尿病肾病分期Ⅲ(n=8) 28±6Ⅳ(n=11) 36±6* ＜0．05Ⅴ(n=8) 43±10*#

糖尿病肾病是糖尿病的一种最常见的慢性微血管并发症，也是糖尿病患者的主要死亡原因之一。DN分为5期。Ⅲ期亦称早期糖尿病肾病，多发生在病程＞5年的糖病肾患者。主要表现为尿蛋白排泄率持续于20～200μg/min(30～300 mg/24 h)，尿常规蛋白定量＜0．5 g/24 h，基底膜增厚和系膜基质明显增加;Ⅳ期即临床糖尿病肾病，以大量白蛋白尿为特点，糖尿白排泄率＞200μg/min(＞300 mg/24 h)，或常规尿蛋白定量＞0．5 g/24 h，肾小球滤过率下降，并出现高血压，基底膜进一步增厚，系膜基质进一步增加，部分肾小球荒废;Ⅴ期即终末期肾衰竭，肾小球滤过率严重减低，患者出现氮质血症，水肿及高血压加重，肾小球广泛硬化、荒废［6］。Ⅰ期、Ⅱ期糖尿病肾病仅靠临床症状及各项生化检测指标难以明确诊断分期，故本试验选取Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期糖尿病肾病患者进行研究分析。本研究结果表明在2型糖病肾病患者中，血肌酐水平升高者较血肌酐正常者血清AGEs水平增高。血清AGEs随着分期的进展而增高，Ⅲ期与Ⅳ期、Ⅴ期间存在着显著差异。多元逐步回归分析显示2型糖尿病肾病患者血清AGEs水平与年龄无关，而与分期及HbA1c呈正相关，因Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期病程代表肾功能正常、肾小球滤过率下降、肾功能衰竭的肾功能进展恶化过程，可以认为在2型糖尿病患者中肾功能与长期血糖控制情况是影响血清AGEs的两个因素，肾功能影响更为重要。如前所述，血清AGEs增高是由于产生增多和(或)降解清除减少所致。在2型糖病肾病肾功能损害患者这二方面因素皆存在。尤其Ⅳ期、Ⅴ期患者，肾小球滤过率明显下降，更加重了AGEs的堆积。

AGEs主要的降解机制为机体多种细胞表面均存在着AGEs受体(AGER)，这些细胞尤其是单核巨噬细胞可以摄取AGEs，并将其降解和最终释放出一种小分子可溶性 AGEs(LMW-AGE)。同样细胞外基质中AGEs受蛋白酶降解，裂解成AGEs片段。这些AGEs降解产物释放入血，由肾脏清除。AGEs在血液透析患者的心血管组织中蓄积，在肾移植患者中减少。提示AGEs蓄积不仅与高血糖(糖尿病)密切相关更与肾功能异常关系密切。AGEs在糖尿病肾病中的致病作用已得到证实。AGEs的以下作用与DN有关:(1)与肾小球系膜细胞上的特异性AGEs受体结合增加细胞因子的释放和细胞外基质(ECM)的产生［7］;(2)与胶原蛋白发生交联使蛋白质在组织中的沉积增加，降低基质降解酶活性使ECM成分降解减慢;(3)灭活一氧化氮(NO)，影响肾脏血流动力学，修饰脂蛋白与糖尿病动脉粥样硬化发生密切相关;(4)损伤DNA和核酸蛋白影响蛋白质的转录和表达等。因此AGEs造成糖尿病肾病患者系膜基质堆积、肾小球和肾小管基底膜增厚，选择性通透能力丧失和蛋白尿发生［8］。最终导致肾小球硬化。

1 刘志红，黎磊石．探索糖尿病肾病防治的新途径．肾脏病与透析肾移植杂志，2002，11:1-2．

2 Harrington CR，Colaco CA．Alzheimer’s disease．A glycation connection．Nature，1994，370:747．

3 Vlassara H，Palace MR．Diabetes and advanced glycation endproducts．J Int Med，2002，251:87-101．

4 Schiel R，Franke S，Busch M，etal．Effectof smoking on risk factors for cardiovascular disease in patientswith diabetesmellitusand renal insufficiency．Eur JMed Res，2003，8，283-291．

5 Bierhaus A，Schiekofer S，Schwaninger M，et al．Diabetes-associated sustained activation of the tranScription factor nuclear factor-kappa B．Diabetes，2001，50:2792-2808．

6 Mason RM，Wahab NA．Extracellular matrix metabolism in diabetic nephropathy．JAm Soc Nephrol，2003，14:1358-1373．

7 Shibata K，Dohi K，Fnjii Y，et al．Intraglomerular eoagulation and fibrindysis in human Primiary glomerular diseses．Nippon Jinzo Gakkai Shi，1991，33:719-729．

8 Shoji T，Koyama H，Morioka’T，et al．Recepter for advanced glycation end products is involved in impaired agniogenic response in diabetes．Diabetes，2006，55:2245-2255．