颈椎旁肌和韧带异常对颈椎退行性变影响的实验研究

孙先泽 申勇 李锋 任亮 顾振芳

颈椎病的起始病因是颈椎间盘退变，在退变的不同时期可出现一些不同病理改变。颈椎不稳是其早期的一个表现［1］。一些因素影响着颈椎间盘的退变和颈椎不稳的发生，但具体机制仍不是很清楚。我们拟在动物模型上重现颈椎退变的过程，从而对颈椎病的发病机制有更深入的了解。

1 材料与方法

1．1 实验动物及分组 实验选用新西兰大白兔36只，雌雄不限，6～9个月龄，体重 2．5～3．0 kg，购于河北医科大学实验动物中心(医动字第DK0507-0102)。将36只动物随机分为实验组与对照组2组，实验组20只，对照组16只，每组再分为4个月(10～13个月龄)和10个月(16～19个月龄)2个亚组，实验组每个亚组10只，对照组每个亚组8只。

1．2 实验仪器 Leica-Rm2152石蜡切片机和Olympus BH-2生物显微镜。

1．3 实验方法

1．3．1 实验准备:术前1 d禁食水，枕后及颈背部备皮。

1．3．2 手术方法:参照文献报道方法造模［2］。将实验动物颈后部剪毛及清洁后，用氯氨酮0．1 g/kg肌内注射麻醉，麻醉成功后将动物俯卧于手术台上，消毒铺巾，从环枕关节至第二胸椎棘突切开长约7 cm皮肤后，暴露棘突，将附着于棘突、椎板及小关节的肌肉全部分离开，然后切断C1棘上和棘间韧带，缝合皮肤。对照组动物同样切开皮肤，但不作肌肉分离和韧带切除。

1．3．3 术后处理:所有实验动物同房间单笼喂养，光照时间及饮食、饮水时间相同，所用饲料由动物实验室标准配置，术后让动物在笼中自由活动，切口以无菌敷料包扎，每日肌内注射青霉素40万U，共3 d，伤口均甲级愈合，缝线于2周时自行脱落。

1．3．4 术后检查及取材:观察组在术后4个月分别作颈椎正侧位、过伸过屈侧位X线摄片，检查完毕后将动物处死，完整取下包含上下终板的C4，5和C5，6椎间盘，标本经10%中性甲醛固定。10个月观察组检查方法及取材方法同上。

1．3．5 切片的制备:经甲醛固定24 h后，切除一侧软骨终板，然后置于乙二胺四乙酸二钠(EDTA)溶液中，每隔2 h换液浸泡，直至另一侧软骨终板能被针头刺入，脱钙成功;将脱钙后的椎间盘浸泡Bouin氏液固定;采用80%、90%、95%、100%乙醇各1 h行梯度乙醇脱水;二甲苯透明2 h;浸蜡2 h;石蜡包埋并修整蜡块后，沿所取椎间盘的矢状切面制作石蜡切片，厚度为5～6μm，将切片分别裱于涂有蛋白甘油的载玻片上，置37℃温箱内干燥24 h;常规方法铁苏木素及伊红行HE染色，中性树胶封片。

1．4 观察指标

1．4．1 X 线片分析:根据 Guigui等［3］介绍的方法进行划线测量水平移位，角位移为经过相邻两椎体下缘直线间的夹角。根据White等［4］在生物力学实验研究中发现当相邻椎体移位超过椎体矢状径的20%作为诊断前后不稳的标准，相邻椎体之间的角位移超过11°时诊断为成角不稳。采用误差为0．02mm的油标卡尺及多用角尺测量椎体的水平位移和角位移。

1．4．2 椎间盘退变程度分级:在Olympus BH-2生物显微镜下观察每个椎间盘矢状切面情况并进行分级。Miyamoto法对颈椎间盘退变程度作分级评定［5］:Ⅰ级:正常椎间盘结构，外周由规则排列的纤维环和中央大的髓核组成;Ⅱ级:软骨增生，纤维环前部板层状结构的破坏;Ⅲ级:髓核缩小或消失;Ⅳ级:纤维环破裂或出现裂隙;Ⅴ级:髓核突出或有骨化形成。

1．5 统计学分析 应用SPSS 11．0统计软件，计数资料采用四格表确切概率法，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 影像学检查结果 对照组4个月未见椎间隙狭窄、骨赘形成和序列异常。实验组4个月无骨赘形成，但有不稳定存在。对照组10个月与实验组4个月基本相同。实验组10个月可见椎间隙狭窄、骨赘形成，多见于 C4，5、C5，6、C6，7，且有不稳定存在，不稳定均存在于 C4，5和 C5，6，出现不稳定的节段数。4个月实验组与对照组相比出现不稳的节段数的阳性率无统计学意义(P＞0．05)，10个月实验组与对照组相比出现不稳的节段数的阳性率有统计学意义(P＜0．05)。见表1。

表1 2组颈椎不稳定阳性率比较 个(%)

2．2 颈椎间盘退变的组织学表现 4个月对照组动物的组织学无明显变化，椎间盘的中央是大的髓核，周围是规则的纤维环，终板包括一层薄的透明软骨。10个月对照组可见椎间盘退变，包括髓核的缩小和纤维环板层结构的紊乱。4个月实验组椎间盘的退变较明显，主要包括髓核的缩小或消失和纤维环出现裂隙，部分椎间盘可以突出。10个月实验组椎间盘退变更加明显，以椎间盘突出和骨赘形成为特点。对照组10个月Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级退变率与4个月比较，差异有统计学意义(P＜0．05)。4个月时实验组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级退变率与对照组相比退变明显(P ＜0．05)，10个月时实验组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级退变率与对照组相比退变更加明显(P＜0．05)。见表2。

表2 2组兔颈椎间盘光镜下退变程度分级情况比较个(%)

3 讨论

颈椎的活动节段是颈段脊柱的基本功能单位，它由上下相邻的两节颈椎及其附着的软组织组成，是颈椎最小的功能单位。正常人体颈椎稳定性由两大部分来维持［6］:一是内源性稳定，包括椎体、附件、椎间盘和相连的韧带结构，为静力性平衡，二是外源性稳定，主要为颈部肌肉的调节与控制，它是脊柱运动的原始动力，为动力性平衡。本实验通过剥离椎旁肌，切除棘上、棘间韧带，使正常的内外源稳定系统均遭到破坏，引起兔的下颈椎退变来模拟人的下颈椎退变，对下颈椎退变的发病机制进行研究，通过4～10个月的观察，出现了颈椎退行性不稳的表现，4个月实验组与对照组相比出现不稳的节段数的阳性率差异无统计学意义(P＞0．05)，说明即使存在力学的不稳，4个月也不足以引起明显的颈椎的节段不稳。10个月实验组与10个月对照组相比出现不稳的节段数的阳性率有统计学意义(P＜0．05)，说明10个月出现了明显的颈椎不稳，力学的不稳加速了颈椎退行性不稳的出现，进一步说明肌肉和韧带对维持颈椎稳定性的重要性。

椎间盘由4层同心圆形排列的组织组成，由外向内依次是:(1)外层纤维环:是一层环形的高密度包裹胶原纤维，主要由成纤维样细胞、纤维细胞组成。(2)内层纤维环——纤维软骨层。(3)过渡区:介于纤维环和髓核间，内层纤维环和过渡区细胞酷似软骨细胞。(4)中央的髓核，髓核中包含原始的脊索细胞，到成年后脊索细胞逐渐消失，只剩余软骨样细胞［7－9］。椎间盘体积和形状随成长而变化，待骨骼成熟以后又发生相反的变化，而且人与人之间，同一人的不同椎间盘之间生长和退变的速度和程度也不一样，但过程是相似的，而且在很大程度上退变发生在髓核。髓核中的细胞数、蛋白多糖及水均减少，同时出现蛋白多糖碎片的聚集［7－10］。总之，椎间盘的完整性有所减弱，椎间盘的容量和形态开始变化，椎间盘突出的可能性增大，随着年龄的增大，外层纤维环内的组织变成硬的软骨盘，椎间盘的高度降低，中心部位碎裂的椎间盘及裂隙更加明显，髓核变得更小，周围胶原纤维的密度及排列方式发生改变，几乎没有什么细胞存在，椎间盘高度和组成成份的改变影响了脊柱的稳定性，改变了脊柱的力线，关节突关节、韧带及椎旁肌承担了更多的载荷，所有这些变化与脊柱的稳定性、椎管狭窄和关节突的退变有一定关系。由于颈椎骨的刚度明显大于椎间盘的刚度，在载荷的作用下，因椎间盘变形使颈椎发生位移和旋转，因此颈椎不稳和椎间盘退变互相影响，互为因果。本实验通过剥离兔颈椎旁肌和切除棘上棘间韧带来改变颈椎的力学性能，通过4～10个月的观察，并进行光镜检查，对照组10个月与4个月比较发现随着增龄颈椎间盘的退变明显，差异有统计学意义(P＜0．05)。4个月时实验组与对照组相比退变明显，差异有统计学意义(P＜0．05)，10个月时实验组与对照组相比退变更加明显(P＜0．05)。从以上发现可以得出颈椎肌肉和韧带的异常所导致的力学的不稳诱发和加速了颈椎间盘的退变。

本项研究的局限性在于不能对颈椎不稳所引起的临床症状进行研究，只能得出颈椎椎旁肌及韧带的异常可以加速颈椎间盘退变和颈椎不稳过程。提示我们要重视肌肉和韧带异常对颈椎稳定性的影响。

1 Dai L．Disc degerative and cervical instability．Correlation of magnetic resonance imaging with radiography．Spine，1998，23:1734-1738．

2 彭宝淦，施杞，沈培芝，等．一个新的实验性颈椎病动物模型．中国中医骨伤科杂志，1996，4:10-15．

3 Guigui P，Benoist M，Deberge A．Spinal deformitry and instability after multilevel cervical laminectomy for spondilotic myelopathy．Spine，1998，23:440-447．

4 White AA，Southwick WO，Panjabi MM．Clinical instability in the lower cervical spine:a review of past and current concepts．Spine，1976，1:15-27．

5 Thompson JP，Pearce RH，Schechter MT，et al．Preliminary evaluation of a scheme for grading the grossmorphology of the human intervertebral disc．Spine，1990，15:411-5．

6 王以进，王介麟文编．骨科生物力学．第1版．北京:人民军医出版社，1989．156-191．

7 Buckwalter JA．Fine structural studies of human intervertebral disc．In:White AA，Gordon SL，eds．Idiopathic Low Back Pain．St．Louis:CV Mosby，1982．108-143．

8 Trout JJ，Buckwalter JA，Moore KC．Ultrastructure of human intervertbral disc Ⅱ．Cells of the nucleus pulposus．Anat Rec，1982，204:307-14．

9 Trout JJ，Buckwalter JA，Moore KC，et al．Ultrastructure of human intervertbral disc Ⅱ．Cells of the nucleus pulposus．Anat Rec，1982，204:307-314．

10 Buckwalter JA，Roughley PJ，Rosenberg LC．Agerelated changes in cartilage proteoglycans:Quantitative electron microscopic studies．Microscopy Research and Techniques，1994，28:398-408．