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RP-HPLC测定三种黄连中的生物碱含量

2010-03-21崔国辉袁汉尧周克元

海南医学 2010年16期
关键词:巴马小檗生物碱

崔国辉,袁汉尧,周克元

(广东医学院检验学院临检教研室,广东 湛江 524023)

黄连是毛茛科植物黄连(Coptis chinensis franch)的干燥根茎,文献报道,它含有小檗碱、巴马亭、药根碱、黄连碱等多种原小檗碱型生物碱。祖国医学记载其具有清热、解毒的作用,很早就用于消化系统的治疗和研究。例如鲁劲松等[1]研究发现黄连总生物碱(TA)通过抑制胃炎时黏膜细胞的凋亡从而对幽门螺旋杆菌脂多糖(Helicobacterpylori,LPS)引起的大鼠胃部炎症有保护作用。而黄连中的主要成分小檗碱可以诱导人结肠癌细胞株增殖抑制[2]。利用高效液相色谱可以将黄连中主要的生物碱成分进行分离,可以用于黄连的质量控制以及主要成分含量的测定[3-4],但也存在很多问题,诸如分离差、峰型对称性差、色谱柱寿命短和试剂消耗大的问题。笔者参考有关文献,利用反相高效液相色谱检测黄连中生物碱含量,并对云南黄连、北美黄连以及四川黄连中三种生物碱的含量进行分析比较。同时对其加样回收率、样品稳定性、精密度进行分析。

1 仪器和试药

1.1 仪器和色谱条件 色谱柱为安捷伦 C18柱子(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相为乙腈 -水(48∶52,每 1L含有磷酸二氢钾 3.4 g,十二烷基硫酸钠 1.7 g);流速为 1.0 ml/min;检测波长为 345 nm;进样量为 20μl。

1.2 试药 云南黄连、四川黄连于成都药材市场购买,北美黄连于哈佛大学康景轩教授提供,经由天然药物中心邓亦峰高级研究员鉴定。盐酸小檗碱、盐酸巴马亭、盐酸药根碱对照品由中国药品生物制品鉴定所购买。水为三蒸水,乙腈为色谱纯。甲醇、盐酸为分析纯。

1.3 对照品溶液的准备 精密称取盐酸小檗碱对照品 6.00 mg,盐酸巴马亭对照品 1.65 mg,盐酸药根碱对照品 10.68 mg,分别以浓盐酸 -甲醇(1∶99,V/V)定容于 10 ml容量瓶中,作为对照品溶液。

1.4 供试品溶液的制备 称取黄连药材分别粉碎至过 20目筛,称取约 0.1 g,精密秤定,置于 100 ml容量瓶之中,加浓盐酸 -甲醇(1∶99,V/V)约 95 ml,60℃水浴 15 min,超声振荡 30 min,静置过夜,浓盐酸 -甲醇(1∶99,V/V)定容至刻度,混匀,0.45 μm滤膜过滤,即得。按照上述色谱条件进行测定,以盐酸小檗碱、盐酸巴马亭、盐酸药根碱三种生物碱的对照品确定色谱峰的归属。

1.5 标准曲线以及线性范围 依次分别准确量取盐酸小檗碱对照品溶液 80μl、200μl、240 μl、280 μl、320 μl;盐酸巴马亭对照品 140 μl、200 μl、240 μl、280 μl、360 μl;盐酸药根碱对照品 12 μl、16 μl、24 μl、28 μl、36 μl,以浓盐酸 -甲醇 (1∶99,V/V)定容至 2 ml容量瓶刻度。摇匀,精确吸取上述各溶液 20μl,按照上述色谱条件进行测定,以进样浓度为横坐标(X),3次测量得到的峰面积均值为纵坐标(Y),峰面积对应的进样量浓度进行线性回归计算,得到盐酸小檗碱、盐酸巴马亭、盐酸药根碱的回归方程。

2 结 果

2.1 线性关系 绘制三种标准品的标准曲线。结果见表 1、表 2、表 3。

表1 药根碱标准品峰面积大小-浓度表(n=3)

表2 巴马亭标准品峰面积大小-浓度表(n=3)

表3 小檗碱标准品峰面积大小-浓度表(n=3)

2.2 样品测定 取对照品溶液及不同编号的黄连药材供试品溶液,在上述色谱条件下进样,每次20μl,测定峰面积值,用峰面积按外标一点法计算含量,结果见图 1、表 4、表 5。

图1 RP-HPLC色谱图1药根碱(jatrorrhizine) 2巴马亭(palmatine) 3小檗碱(berberine)A混合对照组 B云南黄连样品 C北美黄连样品 D四川黄连样品

表4 三种黄连三种组分的峰面积测定值(n=3,mAUis)

表5 黄连药材的含量测定结果(n=3,%)

2.3 加回收率试验 分别取 3份已测知这三种生物碱含量的黄连药材各约 50 mg,精密秤定,分别精密加入对照品溶液(含盐酸小檗碱 2.8 mg、盐酸巴马亭 0.65 mg、盐酸药根碱 0.46 mg),按供试液制备和含量测定方法操作,结果该法测定黄连药材中的小檗碱、巴马亭、药根碱的加回收率分别为103.8%(RSD为 1.8%,n=3)、103.8%(RSD为3.0%,n=3)、117.4%(RSD为 6.3%,n=3)。结果见表 6。

表6 加收率试验结果比较

2.4 稳定性试验 小檗碱、巴马亭、黄连碱及药根碱等原小檗碱型生物碱的分子结构相似,化学性质亦相似,故选择小檗碱考察方法学稳定性和重现性。取 0.096 mg/ml小檗碱溶液,分别于制备后的 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h进样 ,每次 20 μl,分别测定峰面积,计算相对标准偏差(RSD)。结果表明供试品溶液在 10 h内稳定,盐酸小檗碱峰面积 RSD为 2.4%。结果见表 7。

表7 样品稳定性试验结果

2.5 精密度试验 精密吸取 0.06 mg/mL的盐酸小檗碱对照品溶液,依法进样测定 5次考察仪器精密度,每次 20μl,分别测定峰面积,计算 RSD为0.8%。结果见表 8。

表8 精密度试验结果

3 讨 论

3.1 流动相的选择 黄连中原小檗碱型生物碱属于季铵盐,不易在 C18柱上保留。分离效果较好、峰型对称性好,但是系统平衡时间长。如果不加入离子对试剂,原小檗碱型生物碱等的保留能力下降,分离效果差,峰型托尾。故选用乙腈 -水溶液(48∶52,每 1 L含磷酸二氢钾 3.4 g,十二烷基硫酸钠 1.7 g)作为流动相,峰型对称性较好,与其他的杂质峰完全达到基线分离,取得了满意的效果。

3.2 检测波长的选择 紫外光谱表明,盐酸小檗碱、盐酸巴马亭、盐酸药根碱的吸收曲线形状相似,在 200-400 nm波长范围有两个最大吸收波长(265 nm和 345 nm),且在两个波长处的响应值无明显差别。从色谱图看,以 265 nm为检测波长,基线噪音较高,为 0.04 Mau,以 346 nm为检测波长,基线噪音为 0.02 Mau,因此采用 345 nm为检测波长。

3.3 进样量的确定 在反相色谱中原小檗碱型生物碱保留弱,流动相中有机相比例应较低,而样品试剂主要是甲醇,如果进样量太大,会因为样品在色谱柱中展宽而导致峰型变异。经过方法学试验验证,进样 20μl可以满足各项指标,并且峰型较好。

3.4 柱温的影响 20℃以上测定效果较好,柱温太低,流动相易析出絮状物。

3.5 云南黄连、北美黄连、四川黄连三种黄连生物碱含量的差异没有统计学意义,而云南黄连含量少,北美黄连需要进口,所以可以用国内应用比较广泛的四川黄连在某些方面代替另外两种黄连应用。黄连中主要生物碱药理作用相似,但还是有差别,例如小檗碱对去甲肾上腺素致大鼠胃平滑肌舒张的作用并无明显影响;但巴马亭可增强去甲肾上腺素致大鼠胃平滑肌舒张的作用;而黄连总生物碱可显著对抗去甲肾上腺素致大鼠胃平滑肌舒张的作用,提示小檗碱和巴马亭对 α-受体的作用不显著,而在黄连总生物碱中可能含有可拮抗 α-受体的成分[5]。至于黄连各个品种之间在药理作用方面是不是有差别,以后的研究将进一步阐述。

本文建立了一种简单快速的反相高效液相色谱方法,结果准确可靠,重现性好,可以用于黄连药材中原小檗碱型生物碱的含量测定。

[1] 鲁劲松,刘玉庆,李 明,等.黄连总生物碱对大鼠胃黏膜损伤的保护作用及其机制研究[J].中国中药杂志,2007,32(13)∶1 333-1 336.

[2] 陆 宁,王邦茂,黄迫侠,等.黄连素对脱氧胆酸诱导的人结肠癌细胞株增殖抑制作用及机制[J].中华消化杂志,2006,26(9)∶632-633.

[3] 黄小平,李隆云,瞿显有,等.石柱黄连指纹图谱研究[J].中药材,2006,29(7)∶666-669.

[4] 徐 颖,周世文,汤建林,等.高效液相色谱法测定黄连生药中盐酸小檗碱的含量[J].第三军医大学学报,2007,29(2)∶179-180.

[5] 谭正怀,李杭翼.小檗碱、巴马亭及黄连总生物碱对大鼠胃条的作用比较研究[J].中药药理与临床,2006,22(34)∶48-50.

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