线粒体在卵母细胞成熟和早期胚胎发育中的作用

戴蜜蜜，葛红山，吕杰强

（温州医学院附属第二医院 生殖中心，浙江 温州 325027）

卵母细胞发育、成熟是一个从量变到质变的复杂过程，需经过细胞质成熟和细胞核成熟才具备受精和进一步发育的能力。作为细胞质中含量最丰富的细胞器和细胞的“供能中心”，线粒体在卵子成熟及其后胚胎发育的过程中发挥了极其重要的作用。伴随卵泡发育进程，卵子线粒体发生了许多特征性的变化，影响和左右着卵子成熟及其后的胚胎发育。随着胚胎学和辅助生殖技术的发展，线粒体与卵母细胞成熟及早期胚胎发育之间的关系引起了广泛关注，现将相关研究进展综述如下。

1 线粒体与线粒体基因组

线粒体一般呈粒状或杆状，但因生物种类和生理状态而异，可呈环形、线状、分叉状或其他形状，其在卵子成熟的过程中形态亦有所变化。电镜下线粒体由内外两层膜封闭，包括外膜、内膜、膜间隙和基质四个功能区。内膜向线粒体基质褶入形成嵴，嵴上有基粒。基质为内膜和嵴包围的空间，参与三羧酸循环的酶类均位于基质中，基质中还含有纤维丝和电子密度很大的致密颗粒状物质，内含 Ca2+、Mg2+、Zn2+等离子。

人类线粒体基因组DNA（mtDNA）是一个16569bp的双链闭合环状分子，编码22种tRNA，2种rRNA和13种蛋白质，这13种蛋白质都是呼吸链酶复合物的成分，与核DNA编码生成的多肽一起参与氧化磷酸化。mtDNA可以独立于核DNA之外进行复制、转录和翻译[1]。与核DNA不同，mtDNA缺乏组蛋白的保护和必要的修复机制，且处于高自由基的环境中，因而突变率远较核DNA高[2]。

线粒体是母系遗传的细胞器，人类受精卵中的线粒体几乎全部来自卵细胞。线粒体从母亲传递到子代数量锐减，这就是所谓的“遗传瓶颈效应”，可导致新基因型的快速分离并影响生殖能力[2]。

2 卵母细胞中mtDNA的拷贝数

与体细胞不同，卵母细胞线粒体DNA呈单拷贝状，mtDNA拷贝数可以反映卵母细胞线粒体的数量[3]。卵母细胞的mtDNA拷贝数高度可变，在人类尤为明显，人卵母细胞mtDNA拷贝数变化范围为20000～598000，平均193000。mtDNA在卵母细胞生长、成熟过程中不断复制，从最初不足10个至卵子成熟后20000～500000个[4]。卵母细胞成熟后（MII期）mtDNA复制停止，直至囊胚期才恢复，因此在受精前贮备充足数量的线粒体对卵子受精和早期胚胎发育至关重要。而外源补充（体外注入）大量新鲜、高活力的线粒体可以提高卵子受精和胚胎种植率[5]。

许多研究表明：mtDNA 拷贝数与卵母细胞的受精和早期胚胎发育潜能有着重要关联。Santos等[3]研究显示正常受精的人卵母细胞内mtDNA平均拷贝数为250454±29730，受精失败的卵母细胞内mtDNA平均拷贝数为163698±20192，提示mtDNA含量可反映卵母细胞的质量和受精结局。另外，卵巢功能的好坏对mtDNA的拷贝数亦有影响，May-Panloup等[6]研究表明卵巢功能不全的卵母细胞mtDNA拷贝数平均只有100000±99000，远低于卵巢功能正常组卵母细胞的mtDNA拷贝数（317000±184000），提示卵巢功能不全的卵母细胞发育潜能低下可能与其mtDNA拷贝数低下有关。卵母细胞mtDNA拷贝数亦会随年龄的增长而退化，高龄妇女卵母细胞发育潜能差可能是由于卵母细胞中mtDNA拷贝数下降，或者mtDNA转录水平下降所致[7]。

3 线粒体在卵母细胞成熟过程中的分布情况

线粒体在卵母细胞中的分布具有阶段性，卵母细胞成熟前后线粒体分布发生了明显的变化。刘姗等[8]研究显示人卵母细胞体外成熟前后，线粒体分布由未成熟卵母细胞中以周边分布为主变为成熟卵母细胞中以均匀分布为主。对小鼠卵子的研究还发现卵母细胞成熟过程中，线粒体的核周聚集是细胞质成熟的一部分，缺乏线粒体核周聚集导致了卵子成熟阻滞[9]。

卵母细胞成熟过程中，不同阶段线粒体分布不同，因此线粒体的分布是评价卵子和早期胚胎发育潜能的重要参数[10]。缺乏线粒体在胞质中的重新分布往往标志着细胞质未成熟，这与卵子发育潜能低密切相关。线粒体准确的分布为微管活动提供了能量保证，有助于减数分裂过程中染色体的正常分离，否则可能导致减数分裂异常，引起非整倍体的增加[11]。

4 线粒体膜电位与卵母细胞成熟、早期胚胎发育

线粒体膜电位是细胞活性的关键指标之一，它反映了电子传递和氧化磷酸化过程中质子的转运。线粒体的许多功能，包括蛋白质运输、ATP产生和脂质生成，都依赖膜电位的维持[12]。正常情况下，线粒体高极化状态（膜电位较高），有助于线粒体产生ATP。发育潜能好的卵子线粒体膜电位比发育潜能差的膜电位高[10]。

线粒体膜电位的高低影响氧化代谢水平，若线粒体内膜受到损害引起膜电位降低，导致氧化代谢水平下降，不能产生足够的ATP，可对卵子成熟、受精和胚胎发育结果产生影响。因此，早期胚胎发育阻滞可能与成熟卵母细胞内线粒体活性低下有关。膜电位还与钙离子动态平衡的调控有关。Van Blerkom等[13]认为，MII期卵高极化线粒体和滑面内质网均位于胞质周边，可能参与游离钙离子的局部调节。Jones等[14]比较新鲜收集的人MII期卵与冷冻保存的人MII期卵后发现，冻存人MII期卵细胞质周边线粒体极化丧失，低温冷冻会损伤MII期卵线粒体活性，解冻后的卵子释放游离钙离子进入细胞内的能力减弱。

异常线粒体低膜电位可导致卵母细胞减数分裂异常，引起植入前胚胎镶嵌紊乱[15]。研究发现，高极化和低极化线粒体的比率可反映卵母细胞内异常的线粒体分布和胚胎的代谢缺陷，并影响卵子体内、体外受精能力[16]。线粒体高低极化的比率亦与IVF后胚胎卵裂的碎片率有关[17]。

新近研究表明[18]，卵丘细胞产生的NO可作为调节因子调节线粒体膜电位的高低，主要为抑制作用，卵泡内的低氧环境能加强这种抑制作用。NO和O2的比例高低是否会影响卵胞浆内线粒体的极性还有待于进一步研究。

5 mtDNA突变对卵母细胞成熟及胚胎发育的影响

线粒体是极其敏感的细胞器，卵母细胞成熟过程中体内外环境的变化均可影响mtDNA复制的准确性。mtDNA缺乏组蛋白的保护和必要的自我修复能力，且处于高自由基的环境中，因此极易发生结构突变。另外因mtDNA的基因排列得非常紧凑（几乎不含内含子），任何突变都可能累及基因组的重要功能区，产生严重的后果。突变所产生的效应取决于该细胞中野生型和突变型线粒体DNA的比例，只有突变型DNA达到一定数量（阈值）才足以引起细胞的功能障碍，这种现象称为“阈值效应”。mtDNA突变类型多达150多种，包括缺失、插入、重复等，最常见的是mtDNA 4977 bp缺失（也称普通缺失）。mtDNA 4977 bp缺失与卵子衰老、低受精能力、发育阻滞及死亡有关[19]。人卵母细胞mtDNA 4977 bp缺失频率为32.8%，胚胎为8%。在未受精的卵母细胞中mtDNA 4977 bp缺失率显著增加，可达70%以上，高龄及某些不孕妇女比例更高[6]。mtDNA 4977 bp缺失的累积可导致ATPase6、ATPase8、细胞色素氧化酶III和NADH-CoQ等氧化还原酶类基因缺失，从而引起线粒体功能障碍和ATP产生受损，且会干扰卵子成熟、受精及胚胎发育[20]。Gibson等[21]检测猕猴MII卵发现其mtDNA缺失主要是5740 bp缺失，且这种缺失与猕猴年龄及体外受精结局有相关性。

Lorraine等[22]利用高效液相色谱技术分析26个人卵母细胞，发现8个卵母细胞存在14种点突变，都是A-G突变或T-C突变。这些突变的分布呈现随机性，并表现出不同水平的异质性（<5%～50%）。他们猜测，这些突变可能在卵母细胞发育早期发生，可增加儿童期氧化磷酸化酶系疾病的风险。mtDNA点突变累积呈现年龄依赖性，一种T414G突变在26～36岁病人的卵子中发生率为4.4%，而在37～42岁病人的卵子中发生率为39.5%，两者差异有显著性。这种突变存在于mtDNA调控区，可能在卵子成熟及其后胚胎发育的过程中影响mtDNA的转录和复制。

外源激素刺激也可造成卵子mtDNA 4977 bp缺失率增加，未受外源激素刺激的卵母细胞4977 bp缺失率为21.3%，而接受刺激作用的卵母细胞4977 bp缺失率达71.4%。另外，未受外源激素刺激的卵母细胞与成熟卵母细胞、胚胎以及受精失败的卵子相比，4977 bp缺失率差异存在显著性[21]。

6 线粒体产生ATP为卵母细胞成熟提供能量来源

ATP为卵母细胞成熟、受精、胚胎发育等提供能量保证，线粒体的氧化磷酸化过程是产生ATP的主要方式。卵子发生时线粒体复制和ATP累积对远期发育成熟至关重要[10]。所以，ATP含量可以作为卵母细胞成熟和发育潜能的标志之一，未成熟卵的ATP含量明显低于成熟卵，ATP含量低的未成熟卵，其成熟后受精率也低。

卵子纺锤体的形成需要正常的线粒体功能，减数分裂中期，线粒体为纺锤体形成、染色体分离提供能量，如果线粒体功能异常造成ATP产生不足，就可能影响纺锤体结构，导致非整倍体的发生[23]。氧化应激时线粒体损伤，产生ATP不足，导致纺锤体形态损伤[8]。

使用外源促性腺激素能改变卵子线粒体的能量生产。Lee等[24]的研究显示，注射15 IU hCG或15 IU hCG和15 IU PMSG的金色仓鼠的卵子ATP水平显著高于对照组。过量促性腺激素则可能使ATP产生过量或使抑制ATP产生的底物缺乏，造成ATP产生达到有害水平，进而影响卵母细胞的发育能力。

来自卵母细胞线粒体移植的研究证实，将年轻妇女的卵母细胞线粒体移植入老龄妇女的卵子胞浆，后者的ATP含量会明显升高，并改善了其卵母细胞及胚胎发育能力[25]。

7 展望

探索IVF/ET过程中卵子和胚胎高损失率的机制是当前和今后人类ART和胚胎学研究的焦点之一。随着对线粒体研究的深入，线粒体含量、空间分布、mtDNA拷贝数、膜电位及其产生的ATP对卵母细胞成熟及早期胚胎发育的影响逐渐为人们所了解。鉴于线粒体在卵子发育成熟及早期胚胎发育过程中的变化和作用，我们有理由相信线粒体与ART周期中卵子/胚胎的高损失率间存在着某些重要关联，因此开展更多更广泛的相关研究，以进一步了解线粒体在生殖过程中的作用，具有重要的研究和临床意义。

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