格特隐球菌病暴发流行机制的研究进展

冯晓博,姚志荣

上海交通大学医学院附属新华医院皮肤科,上海200092

格特隐球菌原名为新生隐球菌格特变种,现已上升至种的水平,并被命名为格特隐球菌(Cryptococcusgattii)[1]。格特隐球菌在流行病学和所致感染的临床特点上都与新生隐球菌有明显差异[2,3]。格特隐球菌多感染免疫力正常人群,所致感染多形成肉芽肿病变,需要较长的治疗周期,甚至手术清除病灶,病死率高于新生隐球菌所致感染[1],且格特隐球菌对多种抗真菌药物敏感性较新生隐球菌低[4]。格特隐球菌主要分布于热带和亚热带地区,多引起区域性感染。然而,1999年至今在温带地区温哥华岛暴发的格特隐球菌病发病率是以往报道的10多倍;至2007年止,已报道感染病例218例,且感染者大部分免疫力正常[5,6]。目前,该菌已蔓延至西北太平洋地区,欧洲地区也已发现相关病例[7-10]。本文综述此次格特隐球菌病的流行机制。

1 分子流行病学分析

近年来,在全球范围内进行的大样本调查表明,根据遗传结构和DNA序列差异,格特隐球菌分为4种主要基因型,即VGⅠ～VGⅣ基因型(血清B、C型),主要基因型的地域分布和致病特点存在明显差异[3,6,11]。2004年,Kidd等[6]对温哥华岛地区临床株的基因型进行分析,结果表明这种高致病性的菌株属格特隐球菌VGⅡ基因型。进一步的聚合酶链反应指纹法(polymerase chain reaction fingerprinting,PCR fingerprinting)、扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)以及多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)结果显示,主要致病株为VGⅡa/AFLP6A基因型(占90%左右),另外VGⅡb/AFLP6B基因型占10%左右。2007年,有报道在加拿大不列颠哥伦比亚低陆平原和美国华盛顿州西北部发现VGⅡa亚型感染的人和动物病例,并从环境中分离到该基因型,说明该菌已播散到邻近区域[7-9];另外,在欧洲首次发现VGⅡa亚型感染病例[10]。2009年,在美国俄勒冈州发现由VGⅡa亚型所致的动物病例[12]。Fraser等[13]对全球范围内VGⅡ型菌株所做的MLST表明,VGⅡa亚型在较多位点上都具有独特的序列特征,以此区别于世界范围内其他地区分离的VGⅡ型菌株,而VGⅡb亚型还出现于澳洲、亚洲和南美洲地区[13-15]。2008年,Feng等[16]通过PCR指纹法和4个位点的MLST,首次证实我国广东地区临床中存在VGⅡb亚型相似株,且患者从未出国,证实致病菌来自国内;交配试验显示该致病株具备交配能力。最近,另有报道称巴西帕拉州较高的格特隐球菌病发病率也与VGⅡ型菌株有关(分离率>89%),而进一步的基因分型数据未见报道[17]。

2 致病株的来源

格特隐球菌具有异宗配合的有性生活周期,交配体系中存在α和a两种交配型。交配过程中,交配型为α和a的单倍体细胞融合成双核菌丝,产生融合的锁状联合,双核菌丝的末端分化成担子,在担子中进行细胞核的融合和减数分裂,产生重组的担孢子(basidiospore)。有性交配后产生的担孢子直径小、易于播散,易进入并沉积于肺泡。动物实验表明,有性繁殖产生的担孢子较酵母细胞具有更强的感染力[18]。2005年,Lin等[19]研究发现,α和α相同交配型细胞在一定条件下可以融合成α/α二倍体单核菌丝,通过减数和有丝分裂产生重组的担孢子。α与α交配型菌株在同性交配时,基因组的重组频率与α和a交配型交配时的重组率相似;且子代细胞核型大多为单倍体,少见二倍或非整倍体,表明这种交配行为并非偶然的生物学现象。

对温哥华岛致病株和环境株的交配型分析表明,所有VGⅡ型菌株均为α交配型,且多数具备交配能力,尤其是VGⅡa亚型[6]。为了明确温哥华岛及周边地区VGⅡa亚型致病株的可能来源,Fraser等[13]对世界范围内分离的VGⅡ型菌株进行了MLST,结果显示,温哥华岛的VGⅡa与VGⅡb亚型菌株亲缘关系接近,而与其他地区分离的VGⅡ型菌株亲缘关系较远。30个位点的MLST显示,VGⅡa与VGⅡb亚型有14个位点相同,16个不同。另外,对交配型位点SXⅠα基因序列分析后推断,VGⅡa亚型菌株由同性交配产生。因VGⅡb亚型菌株还出现于澳洲等其他地区,推断VGⅡa亚型为起源于澳洲的VGⅡb亚型与未知VGⅡ基因型间同性交配后产生的重组子代。然而,Meyer等[14]对世界范围内160多株VGⅡ型菌株进行的PCR指纹法、AFLP分析和MLST显示,南美洲有VGⅡa和VGⅡb亚型菌株,其中最早的分离于1986年,提出这些基因型在美洲已存在较长时间,不太可能是近期交配产生的。

3 毒力分析

尽管VGⅡa和VGⅡb亚型菌株在遗传上接近,但临床上的流行率却又显著不同,表明其在致病性上可能存在差异。Fraser等[13]通过建立A/Jcr小鼠吸入感染模型,证实VGⅡa亚型代表株R265毒力明显强于R272和NT-13(VGⅡb亚型)(P<0.001),甚至强于新生隐球菌格鲁比变种H99(P<0.01)。Chaturvedi等[20]通过建立BALB/c小鼠静注感染模型,结果显示菌株NIH444(VGⅡa亚型)的毒力强于WM276(VGⅠ基因型)(P<0.034)。就隐球菌已知毒力因子黑色素、多糖荚膜、磷脂酶和37 ℃生长进行比较,结果显示在生成黑色素方面,因作用底物不同,菌株NIH444与WM276表现各异;但在磷脂酶活性、荚膜形成和37 ℃生长方面两者相似。以上数据表明,VGⅡa亚型的高流行率与其毒力较强有关;而对已知毒力因子的分析结果提示,VGⅡa亚型毒力强的原因可能与未知毒力因子或毒力基因的表达有关。2009年,Ma等[21]研究发现,VGIIa亚型在小鼠模型中表现的强毒力与其线粒体基因组的高表达及其在巨噬细胞中增强的复制和寄生机制相关。

4 致病菌播散机制

格特隐球菌感染主要由宿主从环境中吸入隐球菌的酵母细胞或担孢子引起。之前认为桉树是格特隐球菌的栖息处,格特隐球菌感染多与环境中的桉树有关。然而,至今已报道在除桉树以外的较多树种、树根周围的泥土、空气、水及鸟类粪便中分离到格特隐球菌[6,7,9,22-24]。对温哥华岛的环境采样分析显示,当地的树、泥土、空气和水中均分离到致病株VGⅡa和VGⅡb亚型,其中,VGⅡa亚型占84%,VGⅡb亚型占12%,其余为VGⅠ基因型(4%)[7]。它们在桤木、树莓、雪松、冷杉、橡树、樱桃树的标本(木屑、树皮、树洞等)中有较高的分离率,而桉树标本中却未发现阳性标本;相应的,致病菌在这几种树的树根周围泥土中分离率也较高。研究表明,上层泥土样本中的菌浓度显著高于泥土下层(P<0.01);致病株的分离和高浓度与泥土中的低湿度和低有机碳含量呈正相关。在水标本方面,海水和淡水中均分离到致病菌;在生存实验分析中,致病菌易存活于常温的海水和蒸馏水中,但当温度降为4 ℃或提高盐浓度后,存活率显著下降。空气标本中,菌浓度与相对湿度呈负相关,致病微粒直径≥3.3 μm的要比直径<3.3 μm的多;阳性空气标本多来自靠近阳性树标本的周围,空气标本中菌密度均数为7 cfu/m3[7,9]。

Kidd等[25]在公共场所的水、泥土和树标本中分离到致病菌,提示致病菌的播散可能与人类活动介导传播有关。另外,从车轮、环境采样人员的鞋上亦分离到VGⅡa和VGⅡb亚型,甚至在与鞋接触过的物体表面分离到致病菌,说明致病菌能被动播散。与静态状况相比,动态情况下,树周围空气中菌浓度将增高10～140倍。以上研究结果说明,车轮、鞋、木屑等物体均可成为介导格特隐球菌VGⅡ基因型播散的媒介物。

综上所述,借助遗传学手段可推断格特隐球菌高致病性VGⅡa亚型的可能起源,不仅为阐明这次暴发流行的根源提供依据,而且可预测今后格特隐球菌病流行的发生;对格特隐球菌致病株的分子流行病学分析,有利于医疗机构对疾病的流行进行监控;对格特隐球菌的播散情况进行调查研究,有助于阐明格特隐球菌及相似病原体的播散机制,为今后该病的防治打下基础。

[1] Kwon-Chung KJ, Boekhout T, Fell JW, Diaz M. Proposal to conserve the name Cryptococcus gattii against C. hondurianus and C. bacillisporus (Basidiomycota, Hymenomycetes, Tremellomycetidae) [J]. Taxon, 2002, 51(4): 804-806.

[2] Speed B, Dunt D. Clinical and host differences between infections with the two varieties of Cryptococcus neoformans [J]. Clin Infect Dis, 1995, 21(1): 28-36.

[3] Meyer W, Castaeda A, Jackson S, Huynh M, Castaeda E; IberoAmerican Cryptococcal Study Group. Molecular typing of IberoAmerican Cryptococcus neoformans isolates [J]. Emerg Infect Dis, 2003, 9(2): 189-195.

[4] Trilles L, Fernández-Torres B, Lazéra Mdos S, Wanke B, Guarro J. In vitro antifungal susceptibility of Cryptococcus gattii [J]. J Clin Microbiol, 2004, 42(10): 4815-4817.

[5] Galanis E, Macdougall L. Epidemiology of Cryptococcus gattii, British Columbia, Canada, 1999-2007 [J]. Emerg Infect Dis, 2010, 16(2): 251-257.

[6] Kidd SE, Hagen F, Tscharke RL, Huynh M, Bartlett KH, Fyfe M, Macdougall L, Boekhout T, Kwon-Chung KJ, Meyer W.. A rare genotype of Cryptococcus gattii caused the cryptococcosis outbreak on Vancouver Island (British Columbia, Canada) [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101(49): 17258-17263.

[7] Kidd SE, Chow Y, Mak S, Bach PJ, Chen H, Hingston AO, Kronstad JW, Bartlett KH. Characterization of environmental sources of the human and animal pathogen Cryptococcus gattii in British Columbia, Canada, and the Pacific Northwest of the United States [J]. Appl Environ Microbiol, 2007, 73(5): 1433-1443.

[8] Upton A, Fraser JA, Kidd SE, Bretz C, Bartlett KH, Heitman J, Marr KA. First contemporary case of human infection with Cryptococcus gattii in Puget Sound: evidence for spread of the Vancouver Island outbreak [J]. J Clin Microbiol, 2007, 45(9): 3086-3088.

[9] MacDougall L, Kidd SE, Galanis E, Mak S, Leslie MJ, Cieslak PR, Kronstad JW, Morshed MG, Bartlett KH. Spread of Cryptococcus gattii in British Columbia, Canada, and detection in the Pacific Northwest, USA [J]. Emerg Infect Dis, 2007, 13(1): 42-50.

[10] Lindberg J, Hagen F, Laursen A, Stenderup J, Boekhout T. Cryptococcus gattii risk for tourists visiting Vancouver Island, Canada [J]. Emerg Infect Dis, 2007, 13(1): 178-179.

[11] Litvintseva AP, Thakur R, Reller LB, Mitchell TG. Prevalence of clinical isolates of Cryptococcus gattii serotype C among patients with AIDS in Sub-Saharan Africa [J]. J Infect Dis, 2005, 192(5): 888-892.

[12] Byrnes EJ 3rd, Bildfell RJ, Dearing PL, Valentine BA, Heitman J. Cryptococcus gattii with bimorphic colony types in a dog in western Oregon: additional evidence for expansion of the Vancouver Island outbreak [J]. J Vet Diagn Invest, 2009, 21(1): 133-136.

[13] Fraser JA, Giles SS, Wenink EC, Geunes-Boyer SG, Wright JR, Diezmann S, Allen A, Stajich JE, Dietrich FS, Perfect JR, Heitman J. Same-sex mating and the origin of the Vancouver Island Cryptococcus gattii outbreak [J]. Nature, 2005, 437(7063): 1360-1364.

[14] Meyer W, Kaocharoen S, Trills L, Jover-Botella A, Escandón P, Castaeda E, Tsui C, Hagen F, Boekhout T. Global molecular epidemiology of Cryptococcus gattii VGⅡ isolates traces the origin of the Vancouver Island outbreak to Latin America [C]. The 24th Fungal Genetics Conference, Pacific Grove, CA, March 20-25, 2007.

[15] Kidd SE, Guo H, Bartlett KH, Xu J, Kronstad JW. Comparative gene genealogies indicate that two clonal lineages of Cryptococcus gattii in British Columbia resemble strains from other geographical areas [J]. Eukaryot Cell, 2005, 4(10): 1629-1638.

[16] Feng X, Yao Z, Ren D, Liao W, Wu J. Genotype and mating type analysis of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii isolates from China that mainly originated from non-HIV-infected patients [J]. FEMS Yeast Res, 2008, 8(6): 930-938.

[17] Santos WR, Meyer W, Wanke B, Costa SP, Trilles L, Nascimento JL, Medeiros R, Morales BP, Bezerra Cde C, Macêdo RC, Ferreira SO, Barbosa GG, Perez MA, Nishikawa MM, Lazéra Mdos S. Primary endemic Cryptococcosis gattii by molecular type VGII in the state of Pará, Brazil [J]. Mem Inst Oswaldo Cruz, 2008, 103(8): 813-818.

[18] Sukroongreung S, Kitiniyom K, Nilakul C, Tantimavanich S. Pathogenicity of basidiospores of Filobasidiella neoformans var. neoformans [J]. Med Mycol, 1998, 36(6): 419-424.

[19] Lin X, Hull CM, Heitman J. Sexual reproduction between partners of the same mating type in Cryptococcus neoformans [J]. Nature, 2005, 434(7036): 1017-1021

[20] Chaturvedi S, Ren P, Narasipura SD, Chaturvedi V. Selection of optimal host strain for molecular pathogenesis studies on Cryptococcus gattii [J]. Mycopathologia, 2005, 160(3): 207-215.

[21] Ma H, Hagen F, Stekel DJ, Johnston SA, Sionov E, Falk R, Polacheck I, Boekhout T, May RC. The fatal fungal outbreak on Vancouver Island is characterized by enhanced intracellular parasitism driven by mitochondrial regulation [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 4106(31): 12980-12985.

[22] Randhawa HS, Kowshik T, Khan ZU. Decayed wood of Syzygium cumini and Ficus religiosa living trees in Delhi/New Delhi metropolitan area as natural habitat of Cryptococcus neoformans [J]. Med Mycol, 2003, 41(3): 199-209.

[23] Abegg MA, Cella FL, Faganello J, Valente P, Schrank A, Vainstein MH. Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii isolated from the excreta of psittaciformes in a southern Brazilian zoological garden [J]. Mycopathologia, 2006, 161(2): 83-91.

[24] Randhawa HS, Kowshik T, Chowdhary A, Preeti Sinha K, Khan ZU, Sun S, Xu J. The expanding host tree species spectrum of Cryptococcus gattii and Cryptococcus neoformans and their isolations from surrounding soil in India [J]. Med Mycol, 2008, 46(8): 823-833.

[25] Kidd SE, Bach PJ, Hingston AO, Mak S, Chow Y, MacDougall L, Kronstad JW, Bartlett KH. Cryptococcus gattii dispersal mechanisms, British Columbia, Canada [J]. Emerg Infect Dis, 2007, 13(1): 51-57.