真菌感染的实验室诊断研究进展

钱琴芳, James E. Kirby

美国哈佛大学医学院病理系,马塞诸塞州02215

真菌的快速检测及鉴定之所以日益重要主要有以下原因:①免疫妥协的高危患者逐渐增多;②致病性真菌谱扩大;③重要的医学真菌对抗真菌药物产生耐药性。本文主要对真菌实验室诊断技术的进展进行综述,通过对真菌病的诊断进行分析,着重阐述应用于现代实验室中有助于早期诊断及经验性抗真菌治疗的实验方法。

1 直接镜检法

临床标本的直接镜检方法简便、成本低廉,一直是真菌检测的首选步骤。其优势在于检测快速且能为鉴定致病真菌类型提供最初线索,有时对形态特别的致病真菌甚至可以直接进行判定。正如革兰染色是检测临床标本中细菌感染时广泛使用的鉴别染色法一样,不同类型的真菌有不同的染色特征,使得真菌酵母相和菌丝相的形态都可以被观察到。如假丝酵母(下称念珠菌)属染色效果极佳,但双相型真菌染色结果不确定。通过使用氢氧化钾及卡尔科弗卢尔荧光增白剂,真菌检测有了进一步的改善。前者可以消化周围组织使真菌形态更明显,后者与真菌细胞壁上的多糖特异性结合从而增加检测的灵敏度和特异度。当患者发生接合菌感染时,因其进展迅速,常需要及时手术治疗以保全患者性命及四肢,此时应用氢氧化钾及卡尔科弗卢尔荧光增白剂对快速检测可能的致病真菌类型,如接合菌纲的毛霉菌属等具有极大的意义。还有很多种真菌根据其在组织内的不同形态特点可以很容易地用这种染色方法进行鉴别,如马尔尼菲青霉、荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌、巴西副球孢子菌、皮炎芽生菌及申克孢子丝菌等双相型真菌,这些真菌通常生长缓慢,且因形态不具特异性,需要复杂的培养鉴定过程。如马尔尼菲青霉的鉴定需要通过特殊的培养技术使其转化至酵母相,因为缺少针对这种双相型真菌的分子探针和抗原检测方法。因此使用氢氧化钾和卡尔科弗卢尔荧光增白剂对组织中的真菌直接进行形态学方面的鉴定极大地有助于快速诊断。

临床实验室对于呼吸道标本中肺孢子菌(Pneumocystisjirovecii)诊断鉴定的金标准始终是直接荧光共轭单克隆抗体(direct fluorescent-conjugated monoclonal antibody,DFA)检测法。虽然某些聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)方法具有较高的灵敏度,但DFA检测法对于某些标本的检测仍具有极佳的灵敏度和特异度。对人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)阳性患者诱导痰的检测,DFA检测法和PCR的灵敏度可分别达到82%和95%。PCR对诱导痰检测的特异度为94%,较DFA检测法略低是因为正常人可能存在少量的定植菌,而传统的DFA检测法检测不到。用DFA检测法作为诊断金标准,则PCR对HIV阳性患者支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage,BAL)检测的灵敏度和特异度分别为100%和98%。值得注意的是,在器官移植患者中微生物的含量通常较低,可能出现假阴性结果,尤其是诱导痰标本。

最近,Wang等回顾性地研究了DFA检测法最适用的诊断方法。在一所市级三级医疗教学医院,发现重复检测肺孢子菌诱导痰标本并不能显著提高诊断率。而且,在HIV阴性患者中诱导痰的检测对诊断并不敏感。于是他们推荐在HIV阴性患者中,最初应采用BAL检测法;而在HIV阳性患者中,当首次诱导痰检测结果阴性后再采用BAL检测法。相反,Pagano等在一项关于患有血液系统恶性肿瘤的HIV阳性患者的回顾性研究中发现,18例患者中有9例诱导痰标本检测出病原体。LaRocque 等也报道156份首次诱导痰检测标本中6份阳性,以及20份重复诱导痰检测中2份阳性,并指出诱导痰检测法可作为HIV阴性患者卡氏肺孢子菌检测的首选方法。我们不清楚为什么这2个研究小组比Wang的小组对肺孢子菌检出率更高。可能的原因包括:带有较高量病原体人群的预筛选,在疾病不同阶段的检测,检测方法或操作的差异,以及诱导痰标本收集技术的不同等。尽管文献中推荐首选的样本检测方法有所不同,但DFA检测法作为卡氏肺孢子菌快速诊断方法的价值是显而易见的,并有可能用下述的辅助技术来补充完善。

2 临床标本真菌抗原的检测

对于临床标本中某一特定真菌或某一类真菌抗原的快速检测有很多方法,举例如下。

2.1 隐球菌抗原

在临床实验室中,乳胶凝集实验已被广泛应用于血清及脑脊液中的新生隐球菌荚膜多糖抗原的检测。这是一种快速简便的检测方法,与常规的印度墨汁染色检测隐球菌荚膜方法比较,具有较高的灵敏度和特异度,因此很多临床实验室已不再使用传统的印度墨汁染色法进行隐球菌的检测。但是在某些播散性毛孢子菌属感染和嗜二氧化碳菌败血症的患者中,偶尔会出现假阳性结果。如当脑脊液中隐球菌荚膜抗原水平较高时,由于前带效应有可能出现假阴性结果。该抗原检测法的优势还在于其为定量检测。比较典型的方法是,对阳性标本进行连续稀释建立浓度梯度(最大稀释法),使其能够检测并反映出抗原的水平及患者的带菌量。连续浓度梯度的建立对接下来的治疗也有一定指导意义,但需要注意的是浓度并不精确,而且在某些治疗成功的患者中,抗原并不一定能完全消失。对评估滴度的改变,用连续标本的两点比较法可以提高准确性。滴度在4倍或4倍以上改变具有临床意义。

2.2 念珠菌抗原

念珠菌属仍然是引起系统性感染最常见的原因之一。相对于细菌败血症而言,念珠菌血症具有死亡率高(49%)、住院时间长、花费大等特点。绝大多数念珠菌感染为白念珠菌和光滑念珠菌。检出和最后鉴定菌种的平均时间,白念珠菌为35 h和86 h,光滑念珠菌为80 h和154 h。最近有研究表明,念珠菌血症的延期治疗极大增加了发病率和死亡率,因此急需对念珠菌的快速检测方法。近来,抗原检测法也成为诊断危险人群早期感染的一种方法。

甘露聚糖与β-葡聚糖同为念珠菌细胞壁的主要成分,被用于念珠菌感染的抗原检测中。Platelia念珠菌抗原EIA(Bio-Rad实验室,美国)使用一种单克隆抗体EB-CA1,去结合并检测念珠菌属的甘露糖戊醇抗原表位。该方法特异性极高,交叉反应性很弱,仅可能与丝状真菌如轮枝样镰刀菌和念珠地丝菌产生交叉反应。有研究发现,可检测的甘露聚糖血症与侵袭性念珠菌感染患者的念珠菌血症有关,表明该检测法有临床应用价值。事实上,在真菌学检测前的几天到几周就可以观察到甘露聚糖血症阳性结果。该法对新生儿重症监护病房中念珠菌病的检测和鉴定颇有优势,敏感度、特异度、阳性预测值及阴性预测值分别为94.4%、94.2%、85%及98%。但该法对于一般患者的灵敏度较低,只有67%。在新生儿中灵敏度较高的原因推测可能有以下:①新生儿血循环中缺少抗甘露聚糖抗体;②血循环中外源凝集素浓度较低;③发生于新生儿的念珠菌病的病理生理学基础不同。需要注意的是,该法对某些种如近平滑念珠菌及克柔念珠菌的灵敏度较低,这些菌可能在成人体内发现的概率更高,至少在器官移植患者疾病预防过程中,克柔念珠菌被发现的概率更高。以上在成人的研究是基于对α-连接甘露聚糖的检测。但在对α-连接和β-连接2种甘露聚糖检测的独立研究中,发现该法在成人中的灵敏度接近90%,存在临床应用的可能。

2.3 马尔尼菲青霉抗原

马尔尼菲青霉是一种东南亚和中国特有的双相型真菌,临床上认为可能是一种存在于免疫妥协患者体内的条件致病真菌。由于培养时间及需转化为酵母相才能诊断使马尔尼菲青霉的培养较为困难。出于对快速鉴定的需要,人们开发了一种酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),即用特异的马尔尼菲青霉甘露糖蛋白抗体检测马尔尼菲青霉抗原。一项临床研究表明,该法可检测出26例青霉病患者中的17例(65%)。另一种酶免疫测定法、斑点印迹ELISA及乳胶凝集实验可通过抗马尔尼菲青霉的多克隆抗体(Mp1p)对尿液标本中的马尔尼菲青霉抗原进行定量分析。在高危人群如艾滋病患者中,这些实验方法检测的灵敏度分别为97%、94%和100%,特异度分别为98%、97%和99%。同样,另一种ELISA使用源于原始培养过滤液的单克隆抗体进行检测的灵敏度为72%,特异度为100%,阳性预测值为100%,阴性预测值为97%。该法在18份经培养证实为阳性的标本中检测出16份阳性结果(89%)。与其他地区检测双相型真菌时采用抗原检测法一样,这些快速检测法对于该地区青霉病的快速诊断极为有用。

2.4 组织胞浆菌抗原

据估计,美国每年有500 000例新发组织胞浆菌感染的患者,这一双相型真菌也被发现存在于包括中国在内的世界各地。对体液中组织胞浆菌抗原的检测较活检和培养法更加有助于快速诊断。在播散性组织胞浆菌感染患者中,超过90%的患者尿中可检测到组织胞浆菌抗原,血清中至少为75%。经过治疗后抗原水平逐渐下降,而复发时抗原浓度增加,这也是监测治疗的有用工具。在肺组织胞浆菌病患者BAL中也可能检测出抗原。事实上,在肺组织胞浆菌病患者中(包括尿抗原阴性患者),BAL的抗原检出率可达84%,提示对已具有肺部症状的患者,可能是一种首选的诊断方法。在中枢神经系统感染患者中,>50%的患者脑脊液中可检测到组织胞浆菌抗原。在播散性感染时也可能在胸膜、心包、腹膜、滑液及眼内液体中查到抗原。这也为特殊部位抗真菌用药及疗程的选择提供了有利的诊断依据。

但是在感染其他双相型真菌的患者中,由于交叉反应的存在也可能出现假阳性结果,这些双相型真菌包括芽生菌等。据报道这一真菌存在于包括中国在内的世界各地,并可引起人类感染。在接受兔抗胸腺细胞球蛋白抗免疫排斥的器官移植患者中,假阳性率近16%。接受兔抗胸腺细胞球蛋白的患者可产生异嗜性抗体,与早期抗原检测法中的组织胞浆菌抗原交叉反应。2004年,MiraVista Diagnostics(美国)推出了第2代组织胞浆菌抗原EIA,提高了敏感度,减少了患者体内异嗜性抗体的交叉反应。因此,与临床实验室的沟通非常重要,要了解患者是否应用了抗胸腺细胞球蛋白,据此选择特异的检测方法。现已出现第3代的定量EIA,测定范围下限为0.3 ng/ml,报告范围为0.6～39 ng/ml。这一新方法的灵敏度还不确定,但据推测应较前2代更高。

2.5 半乳甘露聚糖

烟曲霉病是免疫妥协患者中最常见的侵袭性丝状真菌感染,因其感染部位较深故应用常规的培养技术很难做到及时检测。而且,如何区分是真菌感染还是真菌定植较为关键,因为在这类患者中真菌定植也较为常见。尤其在选择药物如两性霉素B进行治疗时,对这类同时患有多种疾病患者,药物的毒性较大,因此未发生侵袭性真菌感染患者无需用药。血液中真菌及真菌抗体的存在对侵袭性真菌感染诊断尤为特异,因此成为一项重要的诊断标准。血液中丝状真菌的培养诊断不敏感,但曲霉抗原的检测对诊断意义重大。

半乳甘露聚糖是一种大量存在于真菌胞壁的成分,对曲霉属较特异,绝大多数临床检测曲霉抗原的方法都是基于对半乳甘露聚糖的检测。美国食品与药品管理局(Food and Drug Administration,FDA)最近批准了检测血清曲霉半乳甘露聚糖的Platelia曲霉抗原EIA(Bio-Rad),用于深部侵袭性曲霉感染的检测,应用于不同患者群的临床研究。值得注意的是,该检测方法存在判定阈值的问题。检测结果用半乳甘露聚糖指数表示,指数大小取决于标本吸光度/对照判定阈值的平均吸光度。在美国判定阳性结果的指数为0.5,而在欧洲该指数为1.5,这就降低了灵敏度而增加了特异度。不同地区采用不同的阳性结果判定阈值导致很难通过文献进行结果比较,但仍然存在一些普遍现象。如果判定阈值选择1～1.5,则在化疗及造血干细胞移植患者中,该法的灵敏度为67%～93%,特异度为86%～95%。而即使判定阈值选择0.5,肺移植患者中该法的灵敏度仍低于前者(30%)。

虽然以前更普遍使用指数>1.0作为阳性结果的判定阈值,但发现如果采用更低的指数将会更早检测出是否患病。然而对于阈值0.5～0.9的阳性标本,再次检测呈阳性的只有87%;当阈值较大时则有更好的可重复性。后来,Maertens等考查了这一方法的特点,要求连续获得2次阳性结果才可得出真正阳性结论。他们发现选择1.5作为判定阈值,则2次检测阳性的灵敏度为94%,特异度为99%;如果选择0.5,则灵敏度可增加至96.5%,而特异度降低至98.6%。需要注意的是,该项研究中灵敏度较高可能是因为对预检测患病风险高的人具有检测局限性。因此,进行2次检测成为确定阳性结果的标准做法,尤其是在采用较低的判定阈值时。而且,重复实验还可减少由于样本受其他真菌污染而导致的假阳性。

值得注意的是,曲霉半乳甘露聚糖EIA实验也可与其他真菌的半乳甘露聚糖反应,包括青霉属、毛癣属、枝孢霉属、支顶孢霉属、链格孢霉属、镰刀菌属、万吉拉霉属、红酵母属及拟青霉属。曲霉半乳甘露聚糖实验出现假阳性结果可能有以下几种原因。

(1) 患者有其他真菌感染。已有研究表明,该法有望用于东南亚包括中国特有的双相型真菌马尔尼菲青霉感染的早期诊断。在15份证实为青霉病的血清中,有11份通过检测结果为阳性(判定阈值>0.5)。但如果可行的话,前述的特异性检测马尔尼菲青霉抗原的检测法更佳。在1例肺隐球菌感染及隐球菌菌血症的患者中就出现了假阳性结果。进一步研究发现,新生隐球菌的乳木甘露聚糖与半乳甘露聚糖抗原起交叉反应。

(2) 如果对用于半乳甘露聚糖检测的血清样本没有进行充分的无菌操作,也有可能造成真菌污染。所以推荐使用独立的血液标本存放管,而非一管多用,避免实验室的污染。

(3) 还有报道称,使用抗生素如哌拉西林/他唑巴坦和阿莫西林-克拉维酸钾的患者会出现假阳性。哌拉西林源于青霉属,而青霉属胞壁中含有半乳甘露聚糖。在药物生产过程中,半乳甘露聚糖的携带污染是产生假阳性结果的原因。

(4) 儿科患者出现假阳性概率更大。研究表明,该现象可能与儿童及新生儿体内能够与半乳甘露聚糖抗原发生交叉反应的细菌性抗原浓度较高有关。尤其是新生儿肠道内存在大量的双歧杆菌,而存在于该菌细胞壁上的脂膜酸导致了Platelia曲霉检测假阳性结果。

在侵袭性感染的诊断上,抗原检测是否优于影像学检测一直存在争议。以前有研究表明,对血液系统恶性肿瘤患者,半乳甘露聚糖抗原血症要比影像学及临床症状出现早。但Weisser等发现,在侵袭性肺曲霉病中半乳甘露聚糖检测并不优于肺部的计算机断层扫描(computed tomography,CT)。因此,与单纯进行影像学检查相比较,建议对存在真菌感染危险的患者采用不同的检测策略。

半乳甘露聚糖实验也可用于其他体液中曲霉抗原的检测。BAL中半乳甘露聚糖的检测对于诊断侵袭性肺曲霉病很有帮助。如在病程超过10 d的中性粒细胞减少的血液病患者和用氟康唑或伊曲康唑预防治疗的人群中,对侵袭性曲霉感染的灵敏度在确诊患者中为100%,在可能患者中为89%,在疑诊患者中为42%。在该项小样本研究中,特异度为100%。同样,在器官移植患者中灵敏度为100%,特异度为84.2%。但Musher等在另一项规模更大的研究中发现,该法对造血干细胞移植患者,灵敏度只有76%,特异度为94%。现在人们重点关注的是对BAL检测可能造成侵袭性感染的过度诊断,因为非侵袭性曲霉球的定植或存在可能导致假阳性。所以,学者们推荐在检测侵袭性感染时只使用血清标本以增加特异度。

对特殊的解剖腔隙中液体检测对于诊断感染的意义还不清楚,也无相关介绍。半乳甘露聚糖抗原血症患者脑脊液中可检测到半乳甘露聚糖,但在没有明显中枢神经系统受累的情况下,鞘内半乳甘露聚糖抗原的出现可能与腰穿时血液中半乳甘露聚糖进入鞘内造成脑脊液污染或者半乳甘露聚糖通过血-脑屏障渗透入脑脊液有关。在其他组织和体液中,半乳甘露聚糖检测的准确性还不清楚。

2.6 β-D-葡聚糖

(1,3) β-D-葡聚糖〔(1,3) β-D-glucan,BDG〕诊断方法的建立是潜在真菌感染检测方法的重大进步。BDG是存在于绝大多数真菌细胞壁的多糖类组分。接合菌中(如毛霉和根霉)不含BDG,隐球菌中含量极低。2004年美国FDA批准Fungitell(Associates of Cape Cod)作为一种BDG的生色测定法用于真菌感染诊断。该法快速、简单、直接。其原理与鲎变形细胞检测内毒素的原理相似。鲎血液中的凝血因子对BDG和内毒素的激活作用极其敏感。BDG和内毒素分别激活凝血酶联反应过程中的不同分支,这些不同分支最终汇合到最终的共同途径并导致血凝凝固。在Fungitell检测法中,BDG特异性因子和共性因子纯化后可用于BDG敏感且特异的检验。

血清样本中BDG的检测已用于系统性真菌感染的诊断。正常人血清中存在低浓度的BDG,通常为10～40 pg/ml,浓度>80 pg/ml定义为结果阳性。BDG水平不断升高意味着侵袭性曲霉病的病情进展,而降低则与治疗有关。BDG用于诊断侵袭性曲霉病的灵敏度为80%,特异度为81%。该法总的灵敏度60%～100%,特异度为64%～99%。BDG水平升高也可能与念珠菌感染相关。在肺孢子菌感染患者中也可观察到高水平的BDG,因此该方法可与相应的影像学共同用于肺孢子菌性肺炎的诊断。但由于该实验所用的试剂原料鲎的供应量不足,其应用受限。但重组DNA技术无疑能取代这一原始的制备过程,使应用更广泛,费用更低廉。需要指出的是,该方法会出现一些特别的假阳性反应。如在血液制品过滤器和血液透析膜中的纤维素污染可能导致BDG升高的假阳性结果。细菌血症也偶尔会引起假阳性结果,但原因还不清楚。

3 血清样本中真菌抗体的检测

对患者血清中特异性抗体的检测在很久以前就用于双相型真菌感染的辅助诊断,这些双相型真菌包括荚膜组织胞浆菌、皮炎芽生菌、粗球孢子菌及巴西副球孢子菌。荚膜组织胞浆菌和皮炎芽生菌发现于中国,可引起人类感染,因此这些检测方法在中国的医疗实践中非常有用。

马尔尼菲青霉是一种东南亚和中国特有的双相型真菌。在过去10年中有很多关于马尔尼菲青霉血清学检测方法的评估研究,如免疫扩散、间接荧光抗体技术和免疫印迹等。马尔尼菲青霉酵母相抗原检测法比菌丝相抗原检测法灵敏度更高。这一现象并不奇怪,因为人体内存在的马尔尼菲青霉为酵母相,因此成为抗体靶点的可能性更大。人们发现61 000、54 000、50 000、38 000酵母相蛋白有望成为基因重组体的靶点。一项研究表明,马尔尼菲青霉感染患者血清中,86%与61 000抗原反应,71%与54 000抗原反应,48%与50 000抗原反应。但这些实验或者临床样本量较小或者灵敏度较低。用38 000抗原进行免疫印迹时,感染隐球菌或念珠菌的HIV阳性患者中有25%(17/67)呈弱阳性反应,在无症状HIV阳性患者中为17%(45/262)。因为这些患者来自某一特定病区,所以他们是否以前就存在感染或亚临床感染,或者是否为非特异性反应都不清楚。因此,这些血清学方法的应用特点还值得进一步研究。最近,有人开发出抗重组马尔尼菲青霉甘露糖蛋白抗体的ELISA检测方法,显示了良好的应用前景,灵敏度达80%,特异度达100%。

4 培养法检测真菌及其表型鉴定

目前,尚没有针对真菌血培养的正式指南。但是,一般认为血培养丝状真菌的检出率非常低,这与真菌虽以系统感染为主却更易从其他组织分离得到有关。人工溶解离心试管法(Isolator,Wampole Laboratories,美国)是最早用于真菌血培养的方法之一,但需大量人力资源且容易污染。自动化真菌血培养系统,如BACTEC Myco/F Lytic血培养(Becton Dickinson,美国)已经上市,但其培养瓶的价格较人工法要昂贵得多。相对标准血培养需5 d,自动培养需6周,所以比较费时。特别是最近研究表明,大量等同于标准血培养的临床标本(需氧和厌氧的)以及Myco/F Lytic培养可用于鉴定包括念珠菌属和新生隐球菌在内的酵母。因此,分离管检测法和商品化的真菌血培养瓶检测法应该用于较难培养的真菌如荚膜组织胞浆菌,而无需用于包括酵母属和新生隐球菌等在内的常见酵母。由于在这些研究中较少涉及双相真菌和丝状真菌感染的鉴定,因此进一步研究将有助于确定目前所采用的及新型真菌血培养系统检测这些病原真菌的有效性。

几种快速测定物种形成的方法可用来检测培养基中生长的真菌,包括芽管实验、海藻糖同化实验和PNA-FISH。芽管实验是用来推断鉴定白念珠菌的一种简单方法,虽然不能区分白念珠菌与极少分离到的都柏林念珠菌,但因其简单、便宜,仍被广泛应用于推断性鉴定从有菌物质中分离出的白念珠菌。从有菌物质中明确鉴定出白念珠菌并不可行,因为这两种物种对抗真菌试剂都同样敏感。海藻糖同化实验是快速推断性鉴定光滑念珠菌的另外一种方法(3 h内)。光滑念珠菌是从血液感染中分离出的第2种常见的酵母。

人工和自动化生化检测板都可用于真菌临床分离株的鉴定。传统的人工API 20C AUX酵母鉴定板耗费人力,某些菌种的鉴定需72 h。而自动酵母鉴定系统不仅节约体力,且所需周转时间较短。如微生物生化自动分析系统(VITEK 2)需18 h,显微扫描系统(MicroScan)仅需4 h。临床实验室中使用VITEK 2自动检测系统(BioMerieux,法国)的ID-YST卡鉴定常见酵母分离株的效果非常明确。早期的VITEK 2 ID-YST卡在鉴定包括都柏林念珠菌、C.inconspicua、挪威念珠菌及隐球菌在内的一些菌种方面还存在一些问题。但一种替代荧光VITEK YST的新型VITEK YST比色卡能较好检测出这些病原真菌,且重复性好。该法可准确鉴定98.2%～98.5%临床分离株,仅有1.0%的假阳性及0.5%未能检测。低识别率从API法的30.0%降至YST法的18.9%,且只需更少的验证实验或补充检测。但对C.inconspicua、克柔念珠菌、郎比可念珠菌及头地霉,YST和API的鉴定率还是很低。因为这些菌常为惰性菌且所需的碳源谱非常相似,而且很少能从临床样本中分离获得。不过,YST在对隐球菌属的鉴定方面已有明确的改进。

诸如CHROMagar和Oxoid BrillianceTM之类的念珠菌呈色琼脂已被广泛应用于念珠菌属的鉴定,通过原培养基颜色的改变来鉴定菌种。这种培养基融合了产色物质,经不同的菌种代谢后可产生不同种的特定颜色。这使得念珠菌属某些菌种的快速鉴定成为可能,并避免由于混合感染所形成的菌落形态难以区分所导致的漏检。由于其具有高特异度(可达100%),对白念珠菌/都柏林念珠菌、热带念珠菌及克柔念珠菌有很好的鉴定效果。

5 分子生物学检测法在检测和鉴定临床标本、培养阳性标本中的应用

念珠菌对抗真菌药物的敏感性相对稳定。因此,美国传染病协会指南推荐根据菌种鉴定结果选择早期抗真菌治疗方案。在合适的药敏试验出现之前,念珠菌的快速鉴定非常关键,可以指导抗真菌药物的选择。因此,尽可能早地对病原真菌作出鉴定很重要。未经FDA批准的一些分子检测方法同样可对样本中的真菌做直接检测。然而,最近发现PNA-FISH对鉴定血培养阳性的白念珠菌和(或)光滑念珠菌非常可靠,灵敏度和特异度分别达99%～100%和100%。2008年一种新的PNA-FISH检测法被FDA批准,用来快速检测和鉴定血培养阳性的白念珠菌/近平滑念珠菌、热带念珠菌及光滑念珠菌/克柔念珠菌,将可能对氟康唑敏感或耐药的菌种区分开来。多元串联式PCR也已用来鉴定血培养阳性的念珠菌及其他真菌,有高度特异度和灵敏度,检测限为每毫升血10 CFU。该方法具有简单、特异性好、价廉以及自动化等优点,非常适合无分子生物学实验经验者操作。从DNA提取到PCR分析,整个过程不超过4 h。另外,使用物种特异性探针的实时PCR检测和对直接来源于阳性血培养基的物种基因扩增后解链温度的分析,与检测金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的商品化方法相似,可能会使这种分析更为直接。另一种用来鉴定临床呼吸系统样本中曲霉和念珠菌的实时PCR法可作为早期诊断这些真菌感染的潜在手段。

分子生物学方法已应用到临床培养标本和组织病理切片中分离所得的双相真菌的明确鉴定。近年来,商品化的荚膜组织胞浆菌、球孢子菌以及皮炎芽生菌的DNA探针已获FDA批准上市并被广泛使用。基于此的杂交法有很高的灵敏度(98%～100%)和特异度(98%～100%),2 h内可获结果。仅金孢子菌属和黑曲霉会有较少见的假阳性;但菌落形态和显微结构特征可避免识别错误。有趣的是,当组织病理显示有组织胞浆菌感染时,AccuProbe也可对组织标本上存在的该菌快速检测。有研究使用该方法成功鉴定出离体雄鹿瓣膜组织上存在的组织胞浆菌。此外,18S和28S rRNA探针已被研制出来鉴定上述的双相真菌和申克孢子丝菌。虽然针对这些病原体,Grocott Methenamine银染法的灵敏度要高出10%,但原位杂交法的特异度可达100%并可辅助鉴定在较罕见组织中形成的不具有诊断性形态特征菌种。因此,该类分子诊断手法将有可能辅助诊断疑难病例。

现已有数种分子生物学方法可用来鉴定马尔尼菲青霉培养株或直接来自临床的标本。目前,已有针对临床马尔尼菲青霉培养株快速检测的单式和套式PCR检测法,采用该菌的特异性18S rRNA基因序列作为探针。这些方法的检测限分别为1.0 pg/μl纯化DNA及1.8 fg/μl纯化DNA。另一种基于马尔尼菲青霉18S rRNA基因序列的半套式PCR法可用于检测纯培养物和临床上确诊马尔尼菲青霉感染的临床病例标本。最近,一种以5.8S rRNA基因序列作为引物的实时PCR检测方法已投入使用,用于血培养和直接来自外周血中的以及血培养阳性的马尔尼菲青霉菌的鉴定。检测限为每毫升血10个酵母细胞。这些PCR法对疾病早期诊断的作用仍有待临床应用来证实,希望能同其他病原真菌鉴定的分子诊断技术一样,在未来得到更多的应用。

PCR法对侵袭性曲霉感染的全血、血清、BAL及活检组织等标本的检测均有效。该法与曲霉半乳甘露聚糖检测法及在欧洲上市的实时PCR法有同样功效。在需要检测的血清标本量较大时(1 ml),PCR法比半乳甘露聚糖法更敏感。而且,这种实时PCR法中没有发现半乳甘露聚糖法中存在的交叉反应,分析特异度可达100%。

PCR联合DNA测序是目前新兴的临床菌种和真菌培养阳性标本的诊断方法。MicroSeq D2 28S rRNA基因真菌序列试剂盒(Applied Biosystems)已经上市,包括PCR和序列反应剂、软件及真菌序列库。但该试剂盒并未获FDA批准,目前仅在美国注册作为研究用,可对丝状真菌和酵母的临床株作出精确诊断。然而,基因库中缺乏相关序列导致皮肤丝状真菌的鉴定受到限制。ViroDec(Roche Diagnostics)是一种基于网页浏览的序列分析软件,可作为MicroSeq真菌鉴定序列库的替代数据库。

多元探针检测法有望成为检测方法之一。最近一项研究报道一种基于DNA微阵列的系统检测法,可检测从临床样本中分离的多种常见病原真菌,包括念珠菌、新生隐球菌、曲霉、皮肤癣菌、镰孢霉和马尔尼菲青霉。该研究采用通用的真菌探针ITS1和ITS4来扩增非编码ITS区域(ITS1和ITS2)和ITS区域间的5.8S rRNA基因,尽管仅涉及少量临床株,该方法鉴定菌株到属的特异度达100%,到种的特异度达85%。但该研究没有涉及马尔尼菲青霉临床株的检测,还必须要对该法在临床实验室中的应用做进一步评价。现已有液态芯片探针检测法的报道,由于其已应用到呼吸道病毒的诊断,故很可能成功应用于临床真菌的检测。

6 结语

到目前为止,已有很多快速检测方法应用于真菌感染的早期辅助诊断,包括临床标本抗原检测、快速培养检测法以及分子诊断检测法等。随着该领域的快速发展,对不同检测方法优劣的研究探讨也在不断进行中,可以得出以下结论和预期。

首先,简便的抗原检测法将被广泛采用,因设备及人员投入较少且检测迅速。但该法也有特定的临床适用条件。如在适当的地理区域和一定的患病人群中,马尔尼菲青霉的抗原检测可快速确诊并指导临床医生采取恰当的治疗措施。该法甚至可发展为卡片形式的侧流夹心酶联免疫检测法,使其在诊所进行检测成为可能,这也与最近采用的疟疾快速诊断法相类似。

其次,分子诊断学领域有了迅速的进展。自动抽提和实时PCR技术的发展将促进更健全的分子诊断技术越来越多地应用于实验室诊断。分子检测技术费用的降低使分子诊断技术的优势在资源匮乏的地区也能得以展现。一旦投资成立一个分子诊断实验室,就可开展大量不同的检测真菌或非真菌类病原体的检测方法。因此,分子诊断技术将在真菌感染诊断中得到越来越多的应用。这项进步会影响诊断法的多个方面,如临床真菌样本的直接检测(血液中侵袭性曲霉的检测)将由于其诊断特异性而最终取代抗原检测法。此外,分子诊断技术使快速鉴定培养物成为可能,而当前由专家对真菌菌落和镜下形态作出经验性的判断费力且耗时。

总之,本综述所涉及的诊断方法进展将使真菌疾病诊断更加快速、特异,为患者带来福音。