钩端螺旋体外膜蛋白LipL32单克隆抗体的制备及鉴定

王亚琳,张湘燕,王压娣,车小燕,郭晓奎

1. 上海交通大学医学院基础医学院病原生物学教研室,上海 200025; 2. 南方医科大学珠江医院临床医学院基础研究所,广州 510282

钩端螺旋体(简称钩体)属螺旋体目、钩端螺旋体科、钩端螺旋体属。钩体呈细长丝状、圆柱螺旋形。侵入人体以黏膜和皮肤途径最为常见[1]。致病性钩体至少可分为16个基因种、25个血清群、260多个血清型,可引起钩端螺旋体病(简称钩体病)。钩体病是世界范围内流行最广泛的人畜共患病之一,动物宿主达200余种,是潜在的世界性公共卫生问题,我国在1953年已将其列为乙类法定传染病。2003年,我国完成第1株致病性钩体的基因组测序工作[2]。到目前为止,完成测序的钩体株已有6株,为钩体的各项研究工作奠定了良好的基础。

钩体病的临床症状多变,极易与其他疾病混淆[3],故早期实验室诊断对于有效治疗、监控钩体病具有十分重要的作用。钩体病血清学诊断方法包括显微凝集试验(microscopic agglutination test,MAT)和酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)等,用于检测患者血清中针对钩体的特异抗体水平,但不能很好区分现症感染与既往感染。检测钩体抗原的方法,如培养法因耗时长且灵敏度低而不宜用于早期快速诊断;核酸检测法,如聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)等对实验仪器要求高,且特异性低,存在较高的假阳性。

LipL32是迄今为止已知的钩体外膜中含量最丰富的暴露蛋白,是致病性钩体的保守蛋白,有很好的免疫原性,被认为是最好的诊断抗原之一,灵敏度和特异度均可达到90%以上[4]。本实验尝试制备LipL32的单克隆抗体并筛选出其中可用于检测的,以期能克服现有钩体抗原检测中灵敏度和特异度较低等缺点,为快速、准确地检测钩体抗原提供可能。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究使用在中国流行的15株致病性钩体株及1株腐生型株(表1),均来源于中国疾病预防控制中心传染病预防控制研究所。EMJH培养基参照参考文献[3]配置;RPMI-1640、胎牛血清(fetal bovine surum,FBS)、DMEM培养基、庆大霉素购自Gibco公司,十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)购自TaKaRa公司,福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂、50%聚乙二醇1450(polyethylene glycol 1450,PEG1450)、HAT营养选择培养基〔含次黄嘌呤(hypoxantin)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidin)〕、HT营养选择培养基购自Sigma Aldrich公司,辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的羊抗人IgG和IgM购自Sigma公司,HRP标记的羊抗鼠IgM、IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3购自Zymed公司,生物素购自Pierce公司,HRP标记的亲和素购自BioLegend公司。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-D-thiogalactopyranoside,IPTG)购自上海生工生物工程技术服务有限公司,NTA树脂购自上海申能博彩公司,ELISA底物A、B液购自上海晶美公司,酶标板购自康宁公司。SPF级BALB/c小鼠和NS-1细胞株购自第一军医大学实验动物中心。

表1中国流行的15株致病性钩体及1株非致病性钩体的血清群、血清型、菌株及菌号

Tab.1Fifteendominantpathogenicstrainsandonenon-pathogenicstrainofLeptospirainChina

*,the strain number of National Institute for the Control of Pharmaceu-tical and Biological Products;**, non-pathogenicLeptospirastrain.

1.2 方法

1.2.1 免疫原与检测原的制备

1.2.1.1钩体外膜蛋白的分离[5]用EMJH培养基培养黄疸出血群赖株钩体至1×108条/ml后,4 ℃ 8 000g离心30 min;用等培养体积的磷酸缓冲液(phosphate-buffered saline,PBS)(含5 mmol/L MgCl2)4 ℃ 8 000g,洗2次;然后加入1/20培养体积于4 ℃预冷的1% Triton X-114〔含150 mmol/L NaCl、10 mmol/L Tris(pH 8.0)、1 mmol/L EDTA〕冰浴30 min,17 000g离心10 min;取上清液,加入20 mmol/L CaCl2,37 ℃孵育10 min,1 500g室温离心10 min。有机相用4 ℃预冷的丙酮沉淀过夜,次日8 000g离心10 min,沉淀为外膜成分。

1.2.1.2非变性条件下LipL32重组蛋白的表达LipL32重组蛋白以问号钩体黄疸出血群赖株的基因组为模板,表达载体为Pet28b,表达菌株为大肠埃希菌(Escherichiacoli,E.coli)BL21。用1 mmol/L IPTG 22 ℃诱导表达16 h,收集菌体。用1/20细菌生长体积的NTA-0〔20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.9)、0.5 mol/L NaCl、10% glycerol〕和1 mmol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)悬浮细胞,加0.4 mg/ml溶菌酶裂解,然后加0.05% Triton X-100,充分混匀;冰上放置30 min,间或混匀,冰上超声破碎。20 000g,4 ℃离心20 min,取上清液与NTA-0平衡好的NTA树脂混合,4 ℃过夜。次日加入层析柱中,用含0、20、40、60、80、100、200、500 mmol/L咪唑的NTA-0溶液梯度洗脱,收集洗脱液,经蛋白电泳和免疫印迹法鉴定洗脱液中是否含纯的LipL32重组蛋白。将该洗脱液用0.01 mol/L PBS透析、浓缩,考马斯亮蓝法检测蛋白浓度。

1.2.2 单克隆抗体的制备

1.2.2.1动物免疫BALB/c小鼠,雌性,4～6周龄,分2组,每组3只。第1组用LipL32重组蛋白免疫,每次50 μg/只。第2组用LipL32重组蛋白与抽提的外膜蛋白交替免疫,每次50 μg/只。第1次采用福氏完全佐剂,与蛋白液等体积混匀,后3次免疫采用福氏不完全佐剂,每2周免疫1次。测定小鼠血清效价,分别选取2组中免疫效果最佳者于融合前3 d用LipL32重组蛋白腹腔脾内注射加强免疫(100 μg)。

观察患者的心绞痛发作情况(发病次数及时间),记录治疗前、后24 h动态心电图情况,结合冠心病心绞痛疗效标准进行治疗效果评价[3],统计两组患者不良反应发生率。

1.2.2.2抗体效价测定免疫4次后,经尾静脉采血测定血清中抗体效价。取LipL32重组蛋白,钩体56601株全菌超声裂解上清液包板,1 μg/ml,100 μl/孔,4 ℃包被16 h;封闭液(1% BSA、0.1% Tween-20)300 μl/孔,4 ℃封闭16 h,PBS-T洗板3次;血清稀释后加样,37 ℃孵育1 h,PBS-T洗板3次;加1∶1 000稀释的羊抗鼠HRP-IgG,37 ℃孵育30 min,PBS-T洗板5次;加ELISA底物A、B液,避光37 ℃显色10 min,2 mol/L硫酸50 μl/孔终止反应;450 nm波长下测定A值。

1.2.2.3细胞融合挑选2组中免疫效果最佳小鼠,分别取出脾脏,用高温灭菌的铜网研磨,收取细胞,与NS-1细胞按5∶1混合。离心,弃上清液,于37 ℃水浴中缓慢加入1 ml PEG1450,1 min内加完,分别于1、2、3、4、5 min内加1、2、3、4、5 ml无血清RPMI-1640终止融合;最后加入10 ml含15% FBS的RPMI-1640培养基,室温300g离心5 min;弃上清液,用20 ml上述培养基重悬,平均分配至加有饲养细胞的96孔板中,100 μl/孔,37 ℃培养。9 h后,加2.5×HAT、含15% FBS的RPMI-1640,100 μl/孔,进行选择性培养。48 h后,更换为1×HAT,100 μl/孔。

1.2.2.4阳性杂交瘤细胞的筛选与克隆化LipL32重组蛋白、钩体56601株全菌超声裂解上清液作为包被抗原,用间接ELISA检测96孔板中克隆细胞分泌上清液。挑选结果为阳性的继续培养、扩增,以有限稀释法亚克隆化筛选,共进行2次筛选,筛选方法不变。将筛选出的单克隆抗体细胞株扩大培养,用含有空载Pet28b质粒的(E.coli)BL21菌株超声裂解上清液作为包被抗原,用间接ELISA对杂交瘤细胞上清液进行复测,筛选出阴性的细胞株扩大培养并冻存。

1.2.2.5腹水的制备与抗体的纯化取10～12周龄BALB/c雌性小鼠6只,接种细胞前1周,腹腔注射降植烷0.5 ml;收集筛选出的单克隆抗体杂交瘤细胞,按每只小鼠给予6×105个细胞腹腔注射接种;待小鼠腹部胀大后(接种1～2周),引流腹水,可收集多次。采集的腹水采用辛酸/硫酸铵分步沉淀法提纯。提纯抗体经10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)测定纯度。

1.2.3 单克隆抗体生物学特性的鉴定

1.2.3.1亚类包被LipL32重组蛋白于96孔板中,1 μg/ml,100 μl/孔,包被、封闭。加入单克隆抗体细胞株细胞培养上清液,100 μl/孔。一抗为羊血清稀释的羊抗鼠IgG、IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3(按1∶1 000稀释)。ELISA操作步骤同上。

1.2.3.2标记抗体效价采用间接ELISA测定标记生物素的单克隆抗体效价,BSA包被板条作阴性对照。LipL32重组蛋白包被浓度均为1 μg/ml,HRP-亲和素稀释度为1∶1 000,其他操作步骤同上。抗体测定A值/阴性对照A值≥2.1时,抗体最低浓度即为抗体效价。

1.2.4 单克隆抗体的配对

1.2.4.1单克隆抗体标记生物素4.4 mg/ml的生物素溶液30 μl与2 mg单克隆抗体在PBS中作用2 h,再以PBS充分透析,除去游离生物素,将标记好的抗体冻存。

1.2.4.2单克隆抗体之间竞争抑制实验检测表位以重组LipL32蛋白1 μg/ml包板封闭,每孔先加入1 mg/ml纯化的单克隆抗体50 μl,再分别加入生物素标记的单克隆抗体50 μl,37 ℃孵育1 h,PBS-T洗涤3次;加入HRP-亲和素,37 ℃孵育30 min,PBS-T洗涤5次;加入TMB显色液,37 ℃避光显色15 min,450 nm波长下测定A值。以单克隆抗体对同一生物素标记单克隆抗体的抑制为阳性对照,以已知无关单克隆抗体对标记单克隆抗体的抑制为阴性对照,计算各单克隆抗体间的抑制率。抑制率计算公式:(1-各孔测定值/阴性对照值)×100。抑制率>75%为相关,50%≤抑制率≤75%为不完全相关,25%≤抑制率<50%为不相关,抑制率<25%为完全不相关。

1.2.4.3配对实验包被抗体10 μg/ml,封闭后检测。采用双抗夹心ELISA两步法进行29株抗体的相互配对实验,检测LipL32蛋白设50、25、12.5、6.25、3.125 ng/μl共5个稀释度,检测钩体56601株全菌超声裂解上清液设500、250、125、62.5、31.25 ng/μl共5个稀释度,无关蛋白为阴性对照,稀释液为空白。所有样品检测加样均为100 μl/孔。选择检测结果中A值均较高、空白与阴性对照值低的抗体对15株中国流行的及1株非致病性的钩体再次检测。选择对该流行的15株A值高而对非致病株A值低的抗体保存备用。

1.2.4.4特异性鉴定选取SARS病毒、登革病毒、金黄色葡萄球菌、曲霉的全菌超声裂解上清液作为包被抗原,用间接ELISA检测29株单克隆抗体的特异性。ELISA操作步骤同上。

2 结果

2.1 SDS-PAGE和蛋白免疫印迹法鉴定29株单克隆抗体

29株单克隆抗体细胞株是以腹腔接种小鼠制备的腹水型单克隆抗体,用辛酸/硫酸铵分布沉淀法纯化,纯化后单克隆抗体经SDS-PAGE分析,抗体热变性后分解为2条相同的重链(50×103处)和2条相同的轻链(25×103处),IgM的重链相对分子质量(Mr)偏大些。SDS-PAGE分析显示,所得单克隆抗体纯度除22号外均较高(图1)。

M, protein molecular marker; 1-29, mAbs against LipL32.

图129株LipL32单克隆抗体SDS-PAGE分析

Fig.1SDS-PAGEanalysisof29monoclonalantibodiesagainstLipL32

蛋白免疫印迹法检测29株单克隆抗体,结果如图2所示,29株单克隆抗体在30×103处有一明显条带,表明29株单克隆抗体均与LipL32重组蛋白发生反应,且大部分条带单一、特异性好。阴性对照为单克隆抗体稀释液。

图2蛋白免疫印迹法检测29株LipL32单克隆抗体与钩体抗原的特异性结合

Fig.2Specificreactivityof29monoclonalantibodiesagainstLipL32withLeptospiraantigenbyWesternblotanalysis

2.2 单克隆抗体的生物学特性

29株生物素标记的单克隆抗体经间接ELISA检测,效价均在200 000以上,都可用来进行配对实验。其中单克隆抗体1、2、7、10、12、18为IgG2b类,3、4、5、6、9、11、13、14、15、16、19、20、21、26、27为IgG1类,8、23、25、29为IgG2a类,24、28为IgM类,22为IgG3类,17为其他亚类。

2.3 竞争抑制实验结果

根据公式计算出各单克隆抗体间的抑制率,从而可看出各单克隆抗体间的抗原表位是否相同或存在交叉。结果这29株单克隆抗体的识别表位可分为8个组。第1组:1、7、8、12、17、25;第2组:2、9、10、20;第3组:3、14、23、27、29;第4组:4、5、6、11、13、18、26;第5组:19、21、22;第6组:24、28;第7组:15;第8组:16。这8个组代表8个不同的抗原识别表位。

2.4 配对实验结果

用LipL32重组蛋白和钩体56601株全菌超声裂解上清液作为检测抗原进行配对实验,挑选16对检测效果较好的单克隆抗体为候选做进一步筛选。这些单克隆抗体分别为2/b-17、2/b-26、4/b-10、6/b-10、7/b-2、7/b-10、9/b-7、9/b-26、12/b-2、12/b-10、19/b-7、19/b-10、19/b-12、20/b-7、20/b-12和27/b-10。再用15株中国钩体流行株和1株非致病性钩体作为检测抗原,再次筛选候选单克隆抗体。结果19/b-12可检测出15株中国钩体流行株,并与1株非致病性钩体无交叉反应;检测LipL32重组蛋白灵敏度达1 ng/ml,与SARS病毒、登革病毒、金黄色葡萄球菌和曲霉的菌体抗原无交叉反应,灵敏度与特异度均非常理想。

3 讨论

LipL32是钩体外膜中含量最丰富的蛋白,且在致病性钩体中高度保守,在钩体病的诊断、疫苗研制及致病机制等方面发挥重要作用。MIF Bioinformatics网站生物信息学分析结果表明LipL32有8个抗原表位,本实验制备的29株单克隆抗体能识别8个不同的抗原表位,已较全面地包含LipL32的抗原表位,且这些单克隆抗体的效价在200 000以上,这既为筛选合适的单克隆抗体提供了很好的候选资源,也为钩体病的其他研究打下了基础。国际上也有LipL32单克隆抗体的文献报道,这些单克隆抗体被应用于诊断和保护性实验,并取得了一定的效果[6]。而且本实验中29株单克隆抗体识别的抗原位点有8个之多,且成功配对筛选出很好的抗原检测单克隆抗体,有着很好的应用前景。

本实验获得了单克隆抗体19/b-12,检测LipL32重组蛋白的灵敏度为1 ng/ml,可与国内流行的15株致病性钩体相关抗原发生特异性反应,而与非致病性钩体菌体抗原无反应。此外,它与SARS病毒、登革病毒、金黄色葡萄球菌的菌体抗原无交叉反应。因此,该抗体可能在钩体抗原的诊断方面具有良好的应用前景。

本实验表达的LipL32重组蛋白在非变性条件下纯化,保证了其免疫原性。由于表达载体是E.coli,为了保证筛选到特异性针对LipL32蛋白天然表位的单克隆抗体,一组小鼠全程用LipL32重组蛋白免疫,另一组小鼠用LipL32重组蛋白与钩体外膜蛋白交替免疫,融合时选择了2组中效价最高的各1只小鼠进行实验。最后筛选到的29株单克隆抗体分别来自这2只小鼠,从抗体数量和抗原识别表位分析,此2组小鼠差异无显著性,从而证实,非变性条件下纯化的LipL32重组蛋白也同样具有很好的免疫原性。

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